Tek Hücre Dizileme Nedir? İlaç Araştırmalarında Teknolojik Atılımlar ve Uygulamalara Katkıları Nelerdir?

Tek hücre dizileme; moleküler biyolojide genomların, transkriptomların ve diğer multi-omik verilerin tekil hücre düzeyinde araştırılmasını sağlayan gelişmiş bir yöntemdir. Zaman içinde onkoloji, mikrobiyoloji, nöroloji, immünoloji ve üreme biyolojisi gibi çeşitli alanlarda güçlü bir araç haline gelmiştir. Geleneksel toplu dizilemenin aksine, tek hücre dizilemesi hücre popülasyonları içindeki heterojenliği ortaya çıkarır ve ayrıntılı hücre haritaları oluşturarak hücresel evrimsel ilişkilere dair iç görüler sağlar.^[1] Bu iç görüler bize daha kesin biyolojik veriler sunarak medikal alandaki gelişmelere katkı sağlar. Buna örnek olarak bir ilacın bir reseptör proteinini ifade eden kanser hücresindeki etkisi verilebilir.

Tek hücre dizileme, devrim niteliğindeki potansiyeli nedeniyle 2013 yılında Nature Methods tarafından "Yılın Yöntemi" seçilmiştir.^[2] Ancak erken dönemdeki başarısına rağmen yüksek işletme maliyetleri yaygın olarak benimsenmesini sınırlamıştır. Yeni nesil dizileme maliyetlerindeki düşüşler, mikroakışkan cihazların geliştirilmesi ve damlacık tabanlı platformlardaki iyileştirmeler dahil olmak üzere teknolojik gelişmeler, tek hücre dizilemesini hem akademik hem de endüstriyel araştırmalar için daha erişilebilir hale getirmiştir. Bu yenilikler, analiz edilebilen ilk birkaç hücreden sonra dramatik bir artışla yüz binlerce hücrenin dizilenmesini sağlamıştır.^[3]

Bu derleme, tek hücre dizileme teknolojisinin gelişiminden özellikle ilaç araştırmalarındaki mevcut uygulamalarına kadar geçirdiği evrimi vurgulamaktadır. Ayrıca bu dönüştürücü teknolojinin gelecekteki yönelimleri de tartışılmaktadır.

Tek Hücre Dizilimi Teknolojisinin İlk Dönemleri

İlk tek hücre cDNA amplifikasyonu 1992'de L. Bertrand ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Çalışmanın odağı olan AMPA reseptörleri, merkezi sinir sistemindeki temel uyarıcı nörotransmiter olan glutamata bağlanarak hızlı sinaptik iletimi sağlar. Bu çalışmada AMPA reseptör alt ünite varyantlarını ve bunların hücresel fonksiyon üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla normalde beyincikte Purkinje tabakasında bulunan Purkinje hücrelerinin mRNA ekspresyonunu araştırmak için tüm hücre yama kayıtları ve RT-PCR amplifikasyonu birleştirilmiştir. Mikroskop altında hücre zarı ile bağlantı kurmak için ince bir cam pipet kullanarak hücre zarını delip hücresel elektrik akımları ölçen "Patch clamp" yöntemi kullanılmıştır. Önce tek purkinje hücrelerinin reseptör agonisti ve antogonist varlığında iyonik akım ölçümleri kaydedilmiş, ardından tekil hücrelerin sitoplazmik içeriği ince cam pipet ile toplanmıştır. Bu içerikler, varyant profili için komplementer DNA(cDNA)'lardaki AMPA alt birimlerinin mRNA dizilerini çoğaltmak üzere RT-qPCR'ye tabi tutulmuştur. Çalışma, spesifik AMPA reseptör alt birim varyantlarının (GluA1, GluA2 gibi) tek hücre düzeyinde sinaptik iletimdeki işlevsel farklılıklarla nasıl ilişkili olduğunu göstermiştir.^[4] Bu çalışmada yüksek verimli dizileme teknikleri kullanılmamış olsa da çalışma tek hücre araştırmalarının modern dizileme teknolojileriyle entegrasyonunun önünü açmıştır.

Tek hücrelerin tüm genom amplifikasyonu 2005 yılında R. Arumugham ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir. Bakteri hücrelerinin genomunu çoğaltmak için çoklu yer değiştirme amplifikasyon (MDA) reaksiyonu ile akış hücre sıralamasını birleştirmişlerdir. Tek hücreler 84 mikro litrelik plaka kuyucuklarına ayrılmış, parçalanmış ve MDA ile tüm genom amplifikasyonuna tabi tutulmuştur.^[5] 2007 yılından itibaren paralel hücre izolasyonu için mikroakışkan odacık çipleri kullanılmaya başlanmıştır. Bu yeni teknoloji, amplifikasyon için gerekli olan başlangıç genomik DNA ve reaktiflerin çalışma hacmini mikro litreden nanolitreye düşürmüş ve özgüllüğü %30'dan yaklaşık %80'e çıkarmıştır.^[6]

Tek Hücre Omiklerinin Geliştirilmesi

2009 yılında Tang ve arkadaşları, yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak tek hücreli tüm transkriptom dizilemesine öncülük etmiş ve tek hücreli RNA dizilemesinde (scRNA-seq) önemli bir ilerleme kaydetmiştir.^[7] Bu teknik, tek tek hücrelerden tüm transkriptomun dizilenmesini sağlayarak tek hücre düzeyinde gen ifadesinin daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır. 2011 yılında Nicholas Navin, meme kanseri hücre plastisitesini ve intratümöral heterojeniteyi araştırmak için tek hücre DNA dizilemesini (scDNA-seq) kullanarak tümörlerdeki genomik çeşitliliğe dair içgörüler sunmuştur.^[8]

Tek hücreli RNA dizileme, 2010 yılında Guo ve arkadaşlarının RT-qPCR kullanarak 500'den fazla hücrede 48 geni analiz ederek hücreleri önceden sıralamadan farklı hücre tiplerinin tanımlanabileceğini göstermesiyle büyük bir değişim geçirmiştir.^[9] Bu çalışma, 2011 yılında Linnarsson grubunun geliştirdiği Tek Hücre Etiketli Ters Transkripsiyon (STRT) gibi daha ileri düzey yöntemlerin temellerini atmıştır. Bu teknikle ters transkripsiyon sırasında cDNA moleküllerini benzersiz barkodlarla etiketlemek için "Kalıp Değiştiren Oligonükleotit" metodunu kullandılar. Bu, cDNA'ları tek bir dizileme reaksiyonunda bir araya getirildiğinde bile tek tek hücrelerin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamıştır.^[10] Bu teknoloji temel alınarak mRNA'nın 5' ucunu yakalayamayan STRT'nin aksine tüm cDNA'yı yakalayan SMART-seq gibi yöntemler geliştirilmiştir. Kütüphane hazırlığı için in vitro transkripsiyon (IVT) kullanan CEL-seq gibi alternatifler de tek hücreli transkriptomik için güçlü araçlar olarak ortaya çıkmıştır.^[3]

What Is A Template Switching Oligonucleotide?

ScRNA-Seq Teknolojisindeki Gelişmeler

ScRNA-Seq methodunun analiz kapsamının ekonomik ve zamansal verimliliğinin gelişmesinde mikro akışkan ve damlacık tabanlı teknolojiler önemli bir rol oynamıştır. Mikro akışkan teknolojilerindeki gelişmeler; özellikle verim, hassasiyet ve maliyet verimliliği açısından tek hücre dizilemesinin iyileştirilmesinde etkili olmuştur. Fluidigm'in C1 sistemi gibi mikro akışkan sistemler, tek hücre izolasyonu ve RNA dizilemesini entegre eden ilk sistemlerden biridir. Bu sistemler, tek tek hücrelerin yakalanması ve dizileme için hazırlanması sürecini otomatikleştirir. Örneğin C1 sistemi, hücreleri 30 dakikanın altında bir sürede 96 mikro akışkan hazneye izole edip yükleyebilir ve geleneksel manuel yöntemlere kıyasla işçilik süresini önemli ölçüde azaltır. Bu sistem gen ifadesi analizinde yüksek hassasiyet ve özgüllüğü korurken çok sayıda hücrenin paralel olarak işlenmesine izin vererek verimi de artırır. Ancak, bu faydalara rağmen C1 sistemi nispeten pahalıdır ve çok büyük hücre popülasyonlarıyla çalışırken ölçeklenebilirlik açısından sınırlamalar olabilir.^[3]

Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade

Damlacık tabanlı mikroakışkan yöntem olarak adlandırılan sonraki yaklaşım, akış mekaniği ile tek tek hücreleri izole etmektedir. Bu yöntemlerin yüksek verimi, tek bir deneyde binlerce ila yüz binlerce hücrenin dizilenmesine olanak tanır; bu da önceki yöntemlere kıyasla dramatik bir artış anlamına gelir. Örneğin, drop-seq'in tek bir çalışmada 100.000'den fazla hücreyi izole ettiği ve işlediği gösterilmiştir. Bu yüksek verim, doku heterojenliğini veya hücre tipi tanımlama araştırmaları gibi büyük ölçekli hücre popülasyonu analizi gerektiren çalışmalar için özellikle avantajlıdır.

Bu yöntemlerde, biri hücreleri, diğeri reaktifleri ve barkodlu boncukları içeren iki sıvı akışı birleştirilir ve yağ eklenerek damlacıklara ayrılır. Her damlacık ideal olarak tek bir hücre içerir ve boncuklar o hücreden gelen RNA'yı etiketlemek için benzersiz barkodlar taşır.^[3] InDrop yöntemi UV salımlı primerlere sahip hidrojel boncuklar kullanırken, Drop-seq yöntemi RNA'yı yakalamak için özel moleküler tanımlayıcılara (UMI) sahip önceden imal edilmiş barkodlu boncuklar kullanır.^{[11], [12]} Barkodlar, her hücreye benzersiz bir kimlik atayarak hangi hücreden hangi RNA molekülünün geldiğini belirler. UMI'ler ise her RNA molekülüne eklenen benzersiz etiketlerdir ve amplifikasyon hatalarını önleyerek RNA moleküllerinin doğru bir şekilde sayılmasını sağlar. Bu iki etiketleme yöntemi birlikte kullanılarak hücrelerin ve RNA'ların doğru bir şekilde tanımlanması ve sayılması sağlanır.

Damlacık tabanlı barkod sistemlerin kullanımı, hücre başına numune ve reaktif tüketimini en aza indirerek reaktif maliyetlerini de önemli ölçüde azaltır. Ancak bu yöntemlerin dezavantajları da yok değildir. Zorluklardan biri, damlacık başına tek bir hücrenin doğru şekilde yakalanmasını sağlamaktır; damlacıklar birden fazla hücre içerdiğinde, bu veri kalitesini tehlikeye atan "çiftler" veya "çoklular" oluşması ile sonuçlanabilir. Ek olarak, damlacık tabanlı kurulumun karmaşıklığı sofistike ekipman ve hassas kalibrasyon gerektirir.^[3]

Evrim Ağacı'ndan Mesaj

Neden Desteğe İhtiyacımız Var?

Aslında maddi destek istememizin nedeni çok basit: Çünkü Evrim Ağacı, bizim tek mesleğimiz, tek gelir kaynağımız. Birçoklarının aksine bizler, sosyal medyada gördüğünüz makale ve videolarımızı hobi olarak, mesleğimizden arta kalan zamanlarda yapmıyoruz. Dolayısıyla bu işi sürdürebilmek için gelir elde etmemiz gerekiyor.

Bunda elbette ki hiçbir sakınca yok; kimin, ne şartlar altında yayın yapmayı seçtiği büyük oranda bir tercih meselesi. Ne var ki biz, eğer ana mesleklerimizi icra edecek olursak (yani kendi mesleğimiz doğrultusunda bir iş sahibi olursak) Evrim Ağacı'na zaman ayıramayacağımızı, ayakta tutamayacağımızı biliyoruz. Çünkü az sonra detaylarını vereceğimiz üzere, Evrim Ağacı sosyal medyada denk geldiğiniz makale ve videolardan çok daha büyük, kapsamlı ve aşırı zaman alan bir bilim platformu projesi. Bu nedenle bizler, meslek olarak Evrim Ağacı'nı seçtik.

Eğer hem Evrim Ağacı'ndan hayatımızı idame ettirecek, mesleklerimizi bırakmayı en azından kısmen meşrulaştıracak ve mantıklı kılacak kadar bir gelir kaynağı elde edemezsek, mecburen Evrim Ağacı'nı bırakıp, kendi mesleklerimize döneceğiz. Ama bunu istemiyoruz ve bu nedenle didiniyoruz.

Destek Ol

Alternatif bir yöntemde, hücrelerin barkodlu boncuklar ve reaktifler içeren kuyucuklara yerçekimi ile izole edildiği bir mikroplaka üzerinde pikolitrelik kuyucuklar kullanır. Bu yöntem karmaşık mikroakışkanlara ve pompalara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu strateji daha basittir ancak damlacık bazlı yöntemlere kıyasla daha düşük bir verimle çalışabilir.^[3]

Özetle C1 mikroakışkan sistemleri, damlacık tabanlı yöntemler ve pikolitre kuyu tabanlı yaklaşımların her biri verim, hassasiyet ve maliyet açısından farklı avantajlar sunarken teknoloji seçimi genellikle deneyin ölçeğine ve özel ihtiyaçlarına bağlıdır. Damlacık tabanlı yöntemler en yüksek verimi ve en düşük reaktif maliyetini sağlayarak büyük ölçekli hücre popülasyonu çalışmaları için idealdir, ancak hücre yakalamada zorluklar ve daha yüksek ekipman karmaşıklığı ile birlikte gelirler. Buna karşılık, C1 sistemleri hassasiyet ve verim arasında bir denge sunar, ancak maliyetleri bazı araştırmacılar için erişilebilirliği sınırlayabilir. Piko kuyu tabanlı sistemler, daha düşük verim sunarken hücre saflığına odaklanan küçük ölçekli çalışmalar için daha basit ve uygun maliyetli bir seçenek sunar.

A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications

Tek Hücre DNA Dizilemesinden (ScDNA-seq) Tek Hücre Tüm Genom Shotgun Dizilemesine (ScWGS-seq) Geçiş

Tek hücre çalışmaları çoğunlukla scRNA seq'e odaklanırken fonksiyonel varyasyonu doğrudan ortaya çıkarma kabiliyeti nedeniyle scDNA-seq gelişim, yaşlanma ve kanser gibi hastalıklarda somatik mutasyonları incelemek için de kullanılmıştır. İnsanın ilk tüm genomunun yani WGS dizisinin yayınlandığı 2012 yılından itibaren scDNA-seq teknolojisi üzerine yapılan çalışmalar hız kazanmıştır.

2013 yılında Wu ve meslektaşları, periferik kan tek hücrelerinde kopya numara varyantlarının (CNV) profilini çıkarmak için düşük kapsama alanlı WGS kullanmışlardır.^[13] 2017 yılına gelindiğinde scWGS-seq yöntemleri ve uygulamaları, genomik heterojenliği, tümör evrimini ve hücre gelişimini gizlemek için tek hücrelerde SNP'leri ve CNV'leri tanımlamak için kullanılmaya başlanmıştır. ^{[14], [15], [16]} ScMethyl-seq metodu metilasyon paternlerinin analizi için kullanılmaya başlanmış ve scATAC-seq & scHi-C gibi metotlar kromatin mimarisini araştırmak için geliştirilmiştir.^[17] Yeni nesil dizileme platformlarını kullanan WGS yöntemleri CNV'leri ve tek nükleotid varyasyonları (SNV) doğru bir şekilde tespit edebilirken SMOOTH-seq gibi üçüncü nesil DNA dizileme platformlarını kullanan yöntemler, tek hücrelerde daha uzun iplikçikleri dizileyerek yapısal varyantları (SV'ler) ve ekstra kromozomal dairesel DNA'ları (ecDNA'lar) tespit etmek için geliştirilmiştir.^[18]

scDNA-seq ve türevleri güçlü araçlar olmalarına rağmen, tek hücreli tüm genom amplifikasyonu (scWGA) denen aşamada üretilen veriler gürültüden muzdariptirler. Tek hücreler sınırlı miktarda DNA içerir ve dizileme için tüm genom amplifikasyonu (scWGA) gerektirir. Bununla birlikte, scWGA eşit olmayan genom kapsamına, alelik dengesizliğe (AI) ve alelik bırakmaya (ADO) neden olabilir. İşleme sırasındaki hatalar yanlış nükleotid değişikliklerine yol açarak gürültülü verilere ve yanlış pozitif ve negatifler de dahil olmak üzere hatalı genotip çözümlemelerine neden olabilir.^[17]

Uzamsal Tek Hücre Dizileme

ScRNA-seq veya scDNA-seq gibi tek hücrelerin tek modlu (mono-omik) çalışmaları, hücre uyum yeteneğinin, fonksiyonel hücre durumlarının, hücre farklılaşmasının ve hücresel yeniden programlama yörüngelerinin anlaşılmasında devrim yaratmaktadır. Bu güçlü araçlar, tüm insan hücrelerinin hücresel referans haritalarını oluşturma misyonuna sahip İnsan Hücre Atlası (HCA) gibi konsorsiyum temelli kaynakların oluşturulması için kullanılmıştır. Ancak her bir hücrenin konumunu, işlevini ve karakteristiğini haritalamak için mono-omik araçlar yetersiz kalmakta ve tek hücre yöntemini uzamsal çözünürlükle birleştiren multi-omik metodolojiler gerektirmektedir.^[19]

Şu anda, uzaysal transkript analizi için iki ana yöntem bulunmaktadır: Floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve uzaysal olarak çözümlenmiş transkriptomik. Bunlardan ilki, tek hücre konumlarının görselleştirilmesi için doğrudan doku kesitinde transkript etiketlemesini kullanır. Nature tarafından 2020'de “Yılın Yöntemi” olarak adlandırılan ikinci yöntem, bir doku kesiti boyunca RNA transkriptlerini yakalamak için oligonükleotid mikro dizileri ve ardından yeni nesil genom dizileme(NGS) teknolojisini kullanır^[20].

Transkriptomik dışında, tek hücreli multi-omik teknolojileri arasında üreme hücreleri hattı ve somatik mutasyonları analiz etmek için scDNA-seq, DNA metilasyon profili için scBS-seq ve scRRBS, kromatin erişilebilirliği için scATAC-seq ve scDNase-seq ve protein bolluğu ölçümü için CITE-seq veya REAP-seq bulunmaktadır. Ek olarak, 10x Genomics Single-Cell Multiome gibi teknikler kromatin erişilebilirliği ve gen ifadesinin eşzamanlı profilini çıkarırken, CyTOF ve PLA yüksek boyutlu protein analizlerine odaklanır. Bu yöntemler, tek hücre çözünürlüğünde hücresel heterojenliğin kapsamlı bir görünümünü sağlar.^[21]

Tek Hücre Dizileme ile İlaç Araştırmaları ve Tedavi Stratejilerinde Devrim

Tek hücre dizileme teknolojileri, özellikle scRNA-seq, ayrıntılı hücresel düzeyde analizlere olanak sağlayarak kanser araştırmalarını ve bulaşıcı hastalık yönetimini dönüştürmektedir. Örneğin, scRNA-seq, fare modellerinin tümör mikro çevresinde (TME) bu belirteci ifade eden spesifik miyeloid hücre tiplerini tanımlayarak kötü kanser prognozuyla ilişkili bir sitokin olan IL-23'ün rolünü incelemek için kullanılmıştır. Bu araştırma sonucu IL-23/IL-23R eksenini katı tümörler için olası bir ilaç hedefi olarak önermiştir.^[22]

Bulaşıcı hastalık araştırmalarında, COVID-19'un Omicron varyantına ilişkin tek hücre verileri, artan bulaşıcılığının üst hava yolundaki transmembran bir protein olan TMPRSS2'nin azalmış ekspresyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, COVID-19 hastalarının otopsi temelli tek hücre analizi viral hedefler, doku hasarı, bağışıklık tepkileri ve genetik risk faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Bu bulgular, tek hücre genomiğinin ilaç keşfi ve aşı geliştirmedeki dönüştürücü rolünün altını çizmektedir.^[23]

İlaç hedeflerinin belirlenmesinin ötesinde tek hücre dizilimi, belirli tedavilerden yararlanma olasılığı en yüksek hasta popülasyonlarının belirlenmesine yardımcı olmaktadır. Bu teknoloji hayatta kalma oranı düşük olan bir meme kanseri alt türü olan üçlü negatif meme kanserinde (TNBC), scRNA-seq tümör heterojenitesini haritalandırarak tedavi sonuçları için kritik prognostik faktörleri ortaya çıkarmıştır.^[24] Benzer şekilde, küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde (NSCLC) scRNA-seq, TME içindeki 44 ana hücre tipini tanımlayarak tümörün hücresel manzarasının kapsamlı bir görünümünü sunmuştur.^[25] İleri seviye bir kanser turu olan ileri refrakter çoklu miyelomda (aRRMM) ise selinexor ve bortezomib gibi ilaçlarla tedavi gören hastalardan alınan plazma hücrelerini analiz etmek, yeni direnç biyobelirteçlerini ortaya çıkarmak ve kişiselleştirilmiş tedavi kararlarını desteklemek için kullanılmıştır.^[26] Bu çalışmalar, hassas tıbbi ve terapötik stratejilerin ilerletilmesinde tek hücre dizilemesinin artan önemini vurgulamaktadır.

Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından İnsan Tümör Atlası Ağı'nın (HTAN) kurulması, tümör ekosistemlerinin yüksek çözünürlüklü haritalarını oluşturarak kanser araştırmalarını daha da hızlandırmıştır. Bu girişim, tanı ve tedavi için potansiyel terapötik hedefleri ve biyobelirteçleri tanımlarken tümör heterojenliği, ilerlemesi ve mikroçevre anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir. HTAN'ın kayda değer bir başarısı, kolorektal kanserin (CRC) poliplerden malign adenokarsinoma ilerlemesini izleyen ve tümör başlangıcı ve ilerlemesi hakkında değerli bilgiler sunan tek hücreli bir tümör atlasının geliştirilmesidir.^{[29], [30]}

Kanser araştırmalarına ek olarak, tek hücre dizilemesi nörolojik hastalıklarda da ilerleme kaydetmektedir. Örneğin scWGS, Alzheimer hastalığı olan hastaların hipokampus ve prefrontal korteksinden 319 ayrı nöronda somatik DNA değişikliklerini incelemek için kullanılmış ve somatik DNA değişikliklerinin farklı modellerini ortaya çıkarmıştır.^[28] Bu araştırmalar tek hücre dizileme teknolojilerinin geniş bir hastalık yelpazesinde artan potansiyelini vurgulamaktadır.

Tek Hücre Dizileme Teknolojilerinin Geleceği ve Önündeki Engeller

Tek hücre dizilemesinin geleceği, özellikle multi-omik entegrasyon ve uzamsal transkriptomik alanındaki ilerlemelerle birlikte muazzam bir potansiyele sahiptir. Bu yenilikler, hücresel heterojenlik ve doku karmaşıklığı hakkında daha derin içgörüler sunarak, özellikle tümör mikro çevresi ve diğer karmaşık dokulardaki hücresel ortamların ve etkileşimlerin hassas bir şekilde haritalanmasını sağlayacaktır. Tek hücre dizilemesinin CRISPR tabanlı gen düzenleme ve yüksek verimli tarama gibi gelişmekte olan teknolojilerle entegrasyonunun, yeni terapötik hedeflerin ve biyobelirteçlerin keşfini hızlandırarak ilaç geliştirme ve kişiselleştirilmiş tıpta devrim yaratması beklenmektedir.^[27]

Bununla birlikte, özellikle mevcut platformların yüksek maliyetleri ve teknik karmaşıklıkları ile ilgili zorluklar devam etmektedir. Damlacık tabanlı sistemler ve mikroakışkan cihazlardaki gelişmeler bu teknolojileri daha erişilebilir ve ölçeklenebilir hale getirmiş olsa da klinik ortamlarda daha geniş kullanımlarını sağlamak için uygun maliyetli çözümlere ihtiyaç vardır.

Ayrıca, tek hücreli tüm genom amplifikasyonu (scWGA) ve diğer amplifikasyon tekniklerinin getirdiği doğal gürültü ve yanlılık, sonuçların doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini engelleyebilir. Bu sınırlamaların ele alınması, hem araştırma hem de klinik uygulamalar için tek hücreli dizilemenin tam potansiyelinin ortaya çıkarılmasında çok önemli olacaktır. Teknoloji geliştikçe bu engellerin üstesinden gelmek, hastalık biyolojisini anlamada ve hassas tedavileri ilerletmede yaygın olarak benimsenmesinin anahtarı olacaktır.