Halkasal mRNA Hücre Fabrikalarının Protein Üretimini Altı Kata Kadar Artırabilir mi?

Günümüzde biyolojik sistemleri yeniden programlayarak onları yaşayan birer üretim tesisine dönüştürme hedefi, sentetik biyolojinin en heyecan verici alanlarından birini oluşturuyor. Ancak bu süreçte hücrelerin protein üretim mekanizmalarını yönetirken sıklıkla kritik moleküler engellerle karşılaşıyoruz. Yakın zamanda geliştirilen yeni bir sentetik biyoloji teknolojisi, mikrobiyal hücrelerin içinde kolayca parçalanan doğrusal mesajcı RNA moleküllerini halka formuna dönüştürerek protein üretiminde dikkat çekici bir artış sağlamayı başardı.

Seul Ulusal Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Bölümünden Prof. Sang Woo Seo liderliğindeki bir araştırma ekibi, mikrobiyal hücrelerin içinde doğrusal mRNA moleküllerini halkasal bir yapıya kavuşturan yenilikçi bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem sayesinde hem mRNA kararlılığı hem de protein üretim verimliliği eş zamanlı olarak artırıldı. Ekip geliştirdiği bu teknolojiye CRESEnT adını verdi.

Halkasallaşmanın gerçekleşmediği kontrol grubuyla karşılaştırıldığında CRESEnT, floresan protein üretimini 5,95 kata ve hücre içi mRNA seviyelerini 3,95 kata kadar artırdı. Ayrıca tek bir mRNA molekülü başına üretilen protein miktarı da 1,51 kat yükseldi. Araştırmacılar bu teknolojinin etkinliğini yalnızca Escherichia coli üzerinde değil; aynı zamanda Bacillus subtilis ve Corynebacterium glutamicum bakterilerinde de doğruladı. Elde edilen bulgular Nucleic Acids Research dergisinde yayımlandı.

Hücresel Fabrikaların Önündeki mRNA Engeli

Mikroorganizmaları biyoyakıtlar, çevre dostu kimyasallar ve ilaç etken maddeleri üretmek amacıyla hücresel fabrikalar olarak sıklıkla kullanıyoruz. Örneğin gıda çeşnilerinde ve hayvan yemlerinde kullanılan amino asitler, mikrobiyal fermantasyon yoluyla her yıl milyonlarca tonluk ölçekte üretiliyor. Bu hücresel fabrikaların verimliliği ise hedeflenen bileşikleri sentezlemek için gereken enzimlerin hücre içinde yeterli miktarda üretilip üretilemediğine doğrudan bağlı bulunuyor.

Gen ifadesini artırmaya yönelik çabalar şimdiye dek çoğunlukla genetik bilginin okunma sürecinin ilk aşamalarında yer alan promotörler ve ribozom bağlanma bölgeleri gibi kontrol unsurlarına odaklanıyordu. Ancak protein üretiminin temel şablonu olan mRNA molekülünün kendisi oldukça kararsız bir yapı sergiliyor. Ökaryot hücrelerdeki mRNA moleküllerinin aksine bakteriyel mRNA moleküllerinin uçlarında başlık veya poli-A kuyruğu gibi koruyucu yapılar bulunmuyor. Bu durum bakteriyel mRNA moleküllerini hücre içindeki RNA parçalayıcı ribonükleaz enzimlerine karşı tamamen savunmasız bırakıyor. Sonuç olarak bakteriyel mRNA molekülleri yalnızca birkaç dakikalık yaşam süreleriyle hızla parçalanıyor.

Doğada yaşayan mikroorganizmalar açısından mRNA moleküllerinin hızla yıkılması, çevresel değişimlere hızla uyum sağlayabilmeleri adına büyük bir avantaj sunuyor. Ancak belirli bir maddenin kontrollü koşullar altında kesintisiz olarak üretilmesinin hedeflendiği hücresel fabrikalarda, üretim şablonu olan mRNA moleküllerinin hızla yok olması verimliliği ciddi ölçüde düşürüyor. Dolayısıyla mRNA molekülünün hücre içinde bozulmadan kaldığı süreyi uzatmak, biyolojik üretim verimliliğini artırmanın en kritik yollarından biri olarak karşımıza çıkıyor.

Doğrusal RNA Moleküllerini Halkaya Dönüştürmek

Araştırma ekibi bu sorunu çözmek için hücre içindeki mRNA miktarını artırmaya çalışmak yerine molekülün biçimini değiştirmeyi tercih etti. İki ucu açık bir ipliği andıran doğrusal mRNA molekülleri, RNA yapısını uçlardan itibaren kemiren enzimlerin açık hedefi hâline geliyor. Bu açık uçları birbirine bağlayarak bir halka oluşturmak ise molekülün söz konusu yıkım yollarına maruz kalmasını büyük ölçüde engelliyor.

Doğada kendi kendini birleştirme yeteneğine sahip olan ve intron adı verilen özel RNA dizilimleri bulunuyor. Bu dizilimler kendi parçalarını kesip çıkarabiliyor ve kalan kısımları yeniden birleştirebiliyor. Araştırmacılar bir intronun ön ve arka parçalarını ters sırada yeniden düzenleyerek hedef genin mRNA molekülünü tasarladı; böylece iki uç hücre içinde bir araya gelerek halkasal bir yapı oluşturdu. Bu akılcı tasarım sayesinde deney tüpünde harici bir işleme gerek kalmadan veya dışarıdan ilave enzimler eklenmeden, canlı E. coli hücreleri içinde mRNA doğrudan halkasal hâle getirildi.

Ekip ayrıca CRESEnT sisteminin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak amacıyla iki temel tasarım ilkesi belirledi. İlk ilke, çevrilmeyen bölgeler olarak bilinen uç dizilimlerin uzunluğuyla ilgiliydi. Bu bölgeler protein kodlamasa da mRNA molekülünün kararlılığını etkileyen sınır bölgeleri işlevi görüyor. Çevrilmeyen bölge gereğinden uzun olduğunda RNA parçalayıcı enzimlere maruz kalan alan genişliyor, çok kısa olduğunda ise intron doğru biçimde katlanamıyor ve halkasallaşma verimi düşüyor. Araştırmacılar yürüttükleri deneylerle her iki uç için en uygun uzunlukları net bir şekilde belirledi.

İkinci tasarım ilkesi ise ayrılmış iki intron parçasının birbirine kusursuz biçimde bağlanmasını sağlayan bir mekanizmayı içeriyor. Araştırmacılar bir fermuarın dişleri gibi birbirine kenetlenecek şekilde tasarlanan kısa dizilimler eklediğinde iki parça birbiriyle çok daha etkin biçimde eşleşti ve halkasallaşma verimliliği belirgin şekilde yükseldi.

Farklı Bakteri Türlerinde Artan Kararlılık

Optimize edilen CRESEnT sistemi uygulandığında halkasallaşmanın gerçekleşmediği kontrol grubuna kıyasla protein üretimi 5,95 kata kadar, hücre içi mRNA seviyeleri ise 3,95 kata kadar artış gösterdi. Transkripsiyon sürecinin yapay olarak durdurulmasının ardından mRNA düzeyindeki değişimlerin izlendiği deneylerde doğrusal mRNA hızla yok olurken halkasal mRNA seviyesinde neredeyse hiçbir düşüş gözlenmedi. Elde edilen bu sonuçlar, protein ifadesindeki artışın doğrudan artan RNA kararlılığıyla ilişkili olduğunu kanıtladı. Üstelik mRNA molekülü başına üretilen protein miktarının da 1,51 kat artması, halkasal yapının protein üretim verimliliğine bağımsız bir katkı sunduğunu ortaya koydu.

Geliştirilen bu yöntemin en önemli güçlerinden biri, sunduğu yüksek uyumluluk ve esneklik olarak öne çıkıyor. Araştırmacılar farklı güçteki promotörlerin ve ribozom bağlanma bölgelerinin bir araya getirildiği çeşitli ifade koşullarında protein üretimindeki artışın korunduğunu gösterdi. Bu bulgu, CRESEnT sisteminin mevcut gen ifadesi kontrol teknolojileriyle sorunsuz biçimde bir arada kullanılabileceğini ortaya koyuyor. Sistem aynı zamanda çeşitli floresan protein türlerinde ve yaklaşık 3,5 kilobazlık büyük bir gende de başarıyla test edildi. Yöntemin etkisi yalnızca farklı E. coli suşlarında değil; Bacillus subtilis ve Corynebacterium glutamicum türlerinde de doğrulandı. Böylece CRESEnT teknolojisinin tek bir mikroorganizmayla sınırlı kalmayan, endüstriyel açıdan değerli pek çok mikrop türüne uygulanabilen evrensel bir platform olduğu kanıtlandı.

Endüstriyel Bileşiklerin Üretiminde Yüksek Verim

Araştırma ekibi bu teknolojiyi sanayide kritik öneme sahip değerli kimyasal bileşiklerin üretimine de uyarladı. Metabolik yolaklarda görev alan enzimleri kodlayan genler CRESEnT ile ifade edildiğinde doğal bir pigment olan flaviolin üretimi 2,74 kat arttı; biyoplastik üretiminin temel hammaddelerinden itakonik asit üretimi 1,52 kat, güçlü bir antioksidan olan likopen üretimi 1,60 kat ve antimikrobiyal ile antikanser özellikleriyle bilinen viyolasein üretimi 1,62 kat artış gösterdi. Kısacası moleküler düzeydeki bu kararlılık artışı, endüstriyel ürün verimine doğrudan yansıdı.

Sistemin halkasallaştırma mekanizması sabit tutulup içerideki gen değiştirilerek CRESEnT çok çeşitli protein ve metabolitlerin üretimine kolayca uyarlanabiliyor. Araştırmacılar bu yöntemin gelecekte ilaçlar ve çevre dostu biyomalzemeler gibi yüksek katma değerli ürünler geliştiren hücresel fabrikalarda yaygın olarak kullanılabileceğini öngörüyor. Prof. Sang Woo Seo elde ettikleri sonuçların sentetik biyolojiye kazandırdığı yeni ufku şu sözlerle açıkladı:

Bu çalışma gen ifadesini düzenlerken yalnızca yazılma ve çeviri aşamalarına odaklanan geleneksel bakış açısının ötesine geçiyor; RNA molekülünün yapısının bizzat değiştirildiği yeni bir RNA topolojisi mühendisliği boyutu kazandırıyor. Mevcut sentetik biyoloji araçlarıyla bir arada uygulanabildiği için bu teknoloji yalnızca mikrobiyal hücre fabrikalarının üretkenliğini artırmakla kalmayıp canlı mikroorganizmalar yoluyla tedavi yöntemleri geliştirme gibi alanlara da genişletilebilir.

Çalışmanın eş birinci yazarları Seongjun Park ve Dr. Giho Kim, sentetik biyoloji temelli gen ifadesi kontrol yöntemleri ve mikrobiyal hücre fabrikalarının geliştirilmesi üzerine çalışmalarını sürdürüyor. İki araştırmacı RNA mühendisliğine dayalı biyolojik üretim platformları alanında yeni araştırmalar planlıyor.