Neden PCR'da kullanılan Taq Polimeraz ısıya karşı dayanıklı ?

PCR'da bulunan Taq polimeraz termofilik arke bakteriden alınmadır. Taq enziminin(Klentaq), E.coli DNA Polimeraz (Klenow) 'dan daha stabilize halde olması yüksek ısıya karşı dayanıklılık sağlar. Enzimlerin yapılarına baktığımızda Taq enziminde glisin daha fazla, bu glisin fazlalılığı glisinin yapısı gereği stabiliteyi artırır çünkü katlanmadan glisini koparmak için daha çok enerji gerekir. Ayrıca enzimin yapısında non-kovalent etkileşimler ve hidrojen bağları fazladır. Ayrıca Taq enziminin katlanma entalpisi yani harcadığı enerji Klenow'un katlanma entalpisinden daha azdır yani Taq daha az entropiktir bu yüzden stabildir. Bu entropikliğin az olması E. coli Pol I'in denatüre halinin, Taq'ninkinden daha genişletilmiş olmasıdır. Ya da diğer bir deyişle Taq katlanırken daha fazla su molekülü salar etrafa bu da daha çökmüş bir yapı oluşturarak entropiyi azaltır.

Özetlemek gerekirse;

• Glisin gibi amino asit farklılıkları
• Katlanırken ortama fazla su vermesi ve çökmüş olması
• Bolca non-kovalent ve hidrojen bağları içermesi
• Katlanma entalpisinin DNA Pol I 'den daha az olması

Bunların hepsi daha az entropik olmasına yani protein stabilitesinin fazla olmasına bu da ısıya karşı dayanıklı olmasını sağlar.

Kaynaktan daha ayrıntılı bilgi edinebilirsin.

PCR yöntemi bir organizmadan total genomik DNA eldesi ile başlar. DNA, bölgeye-özgü primerler (site-specific primer; bölgeye özgü dizayn edilmiş sentetik oligonükleotidler), Taq polimeraz (yüksek sıcaklıklarda da işlev gören, yeni nükleotidlerin eklenmesinde işlev gören bir enzim. Adını, elde edildiği Termus aquaticus termofilik bakterisinden almıştır.), ve MgCl2, tampon, dNTP’ler gibi diğer bileşiklerle bir araya konulur ve denatürasyon (bozundurma), annealing (bağlanma) ve elongation (uzama) basamaklarından oluşan tekrarlı sıcaklık döngülerine maruz bırakılır. Denatürasyon, çift sarmal DNA’yı birbirinden ayırır, böylece primerlerin özel bölgelere yerleşip deoksinükleotid trifosfatlarla (dNTP’ler; A, C, G, T) buluşmasına zemin hazırlar. Daha sonra her iki DNA ipliği de 5’-3’ yönde hedeflenen bölgelerden uzatılır. Denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları bir tur bitip, hedef bölgenin iki kopyası oluştuğunda ilk döngü bitmiş olur. Sonraki döngüler (yaklaşık 30-35 döngü) bu 3 aşamalı sürecin tekrarıdır ve bu şekilde milyonlarca kopya hazırlanabilir.

1970'lerde PCR için E. coli'den elde edilen Klenow fragmenti kullanılıyordu. Ama bu fragment ısıya duyarlıydı ve denatürasyon döngüsünde DNA ile birlikte bu fragment de her seferinde bozunduğundan seri halde tekrarlı döngüler mümkün olmuyordu.

Termus aquaticus bakterisinden elde edilen Taq polimeraz enzimi keşfedilince Klenow fragmenti terk edilip Taq Polimeraz'a geçildi böylece seri halde 30-35 ısıtıp- soğutma döngüsü de PCR için mümkün oldu.