PCR yöntemi bir organizmadan total genomik DNA eldesi ile başlar. DNA, bölgeye-özgü primerler (site-specific primer; bölgeye özgü dizayn edilmiş sentetik oligonükleotidler), Taq polimeraz (yüksek sıcaklıklarda da işlev gören, yeni nükleotidlerin eklenmesinde işlev gören bir enzim. Adını, elde edildiği Termus aquaticus termofilik bakterisinden almıştır.), ve MgCl2, tampon, dNTP’ler gibi diğer bileşiklerle bir araya konulur ve denatürasyon (bozundurma), annealing (bağlanma) ve elongation (uzama) basamaklarından oluşan tekrarlı sıcaklık döngülerine maruz bırakılır. Denatürasyon, çift sarmal DNA’yı birbirinden ayırır, böylece primerlerin özel bölgelere yerleşip deoksinükleotid trifosfatlarla (dNTP’ler; A, C, G, T) buluşmasına zemin hazırlar. Daha sonra her iki DNA ipliği de 5’-3’ yönde hedeflenen bölgelerden uzatılır. Denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları bir tur bitip, hedef bölgenin iki kopyası oluştuğunda ilk döngü bitmiş olur. Sonraki döngüler (yaklaşık 30-35 döngü) bu 3 aşamalı sürecin tekrarıdır ve bu şekilde milyonlarca kopya hazırlanabilir.
1970'lerde PCR için E. coli'den elde edilen Klenow fragmenti kullanılıyordu. Ama bu fragment ısıya duyarlıydı ve denatürasyon döngüsünde DNA ile birlikte bu fragment de her seferinde bozunduğundan seri halde tekrarlı döngüler mümkün olmuyordu.
Termus aquaticus bakterisinden elde edilen Taq polimeraz enzimi keşfedilince Klenow fragmenti terk edilip Taq Polimeraz'a geçildi böylece seri halde 30-35 ısıtıp- soğutma döngüsü de PCR için mümkün oldu.
Kaynaklar
- H. Klenow. Klenow Fragmenti. (4 Haziran 2020). Alındığı Tarih: 20 Kasım 2020. Alındığı Yer: Wikipedia | Arşiv Bağlantısı
