Koronavirüs Tanısında Kullanılan Testler Nelerdir ve Nasıl Çalışırlar?

COVID-19 salgınında en çok tartışılan konulardan birisi, koronavirüsün varlığının saptanması. Bu amaçla dünyanın bir çok bölgesinden yeni kitler üretilmeye başlandı. Benzer zamanlarda farklı şirketler de hızlı-tanı kitleri ürettiğini/geliştirdiğini açıkladılar. Bu süreçte kafalarda çeşitli sorular oluştu; 

• Bu kitler nelerdir? Farkları nelerdir? 
• Güvenirliği yüksek olan bir test kiti nasıl olmalıdır?
• Dünya’da hangi kitler üretiliyor?  

Aşağıdaki tabloda koronavirüsün varlığını saptamak üzere kullanılan 4 farklı yöntem verilmiştir. Tabloda ayrıca bu yöntemlerin nasıl çalıştığı ve sonuçların ne anlama geldiği kısaca özetlenmiştir: 

Finddx

Koronavirüs Testlerine Bir Bakış

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yönteminin farklı tipleri bulunmaktadır. Koronavirüs tanısında kullanılan yöntemin adı Gerçek Zamanlı Reverse Transkriptaz PZR yöntemidir. Fakat bu uzun adlandırma yerine, bu yazımızda kısaca PZR olarak adlandıracağız.

PZR yöntemi kısaca DNA’daki bir gen bölgesinin bir enzim yardımıyla çoğaltılması işlemidir. İnsanlarda olduğu gibi virüsler de fonksiyonel özelliklerini ortaya çıkarmak üzere özelliklerinin kodlu olduğu nükleik asitlere sahiptir (DNA veya RNA). Koronavirüslerde nükleik asit, RNA’dır.

PZR yöntemine geçmeden önce, virüs RNA’sının saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırılma aşaması kısaca çeşitli kimyasallar yardımıyla çöktürme ve ayrıştırma işlemleri ile gerçekleştirilir. PZR yönteminde çoğaltılabilecek bölgeler DNA bölgeleri olduğu için, öncelikli olarak virüse ait RNA’nın DNA’ya dönüştürülmesi gerekmektedir. Bu reaksiyonu Reverse-Transkriptaz enzimi gerçekleştirir.

Britannica

Yani koronavirüslerde yapılan PZR testinde, öncelikli olarak virüs RNA’sı DNA’ya dönüştürülür. Ardından primer denilen hedefleyiciler (nükleik asit dizileri) virüs DNA’sında tanı için hedeflenen gen bölgesine bağlanır. Bu gen bölgesine bağlandıktan sonra çoğaltma reaksiyonunu gerçekleştirmek üzere DNA polimeraz enzimi bağlanır. Eğer doğru primer bağlanması gerçekleşmişse ve koşullar uygunsa enzim, bu gen bölgesini çoğaltır.

PZR teknolojisinde yaşanan gelişmeler ile artık reaksiyonun gerçekleşmesi gerçek zamanlı takip edilebilmektedir. Gerçek Zamanlı PZR yöntemi için benzer primer dizileriyle birlikte özel tasarlanan problar hedeflenen DNA bölgelerine bağlanır. Bu problar çeşitli sinyaller taşıyarak, çoğaltma reaksiyonunu canlı olarak izlememize olanak sağlar. Eğer test yapılan kişide koronavirüs enfeksiyonu (COVID-19) varsa, virüs var olduğu için hedeflenen gen bölgesi çoğalır. Çoğalma işlemi pozitif olarak yorumlanır. Eğer test yapılan kişide koronavirüs enfeksiyonu yoksa, ilgili enzimler virüs RNA’sını bulamayacağı için herhangi bir çoğaltma gerçekleşmez. Gerçekleşmeyen reaksiyon ise negatif olarak yorumlanır. 

Memorial University

PZR Yönteminin Güvenilirliği

PZR yönteminin güvenirliğini arttıran en önemli unsurlardan birisi kullanılan kontrol gruplarıdır. Çünkü test yapılırken;

1. RNA saflaştırılmasında hata olabilir,
2. RNA’lar DNA’ya dönüştürülürken hata olabilir,
3. DNA’nın çoğaltılması sırasında hata olabilir.

RNA saflaştırmasının kontrolü için virüs RNA’sı olduğu bilinen örnekler saflaştırılma protokolünde pozitif kontrol olarak kullanılır. Ardından RNA saflaştırılmasının başarısını PZR belirler. RNA izolasyonu için pozitif olan örnek zaten PZR yönteminde DNA’ya dönüştürülüp, çoğalacaktır. Eğer çoğalma yoksa, bu RNA saflaştırılmasında bir sorun olduğuna işaret eder.

RNA’nın DNA’ya dönüşme başarısını belirlemek için ise doğrudan RNA’lar kullanılır. Bu RNA’lar zaten PZR’unda DNA’ya dönüşüp, çoğalacaktır. Aynı şekilde eğer çoğalma gözlemlenmiyorsa, PZR’unda bir sorun vardır.

Bu sorunun RNA’dan DNA’ya dönüşme kaynaklı mı yoksa DNA çoğaltılması kaynaklı mı olduğunu anlamak için de halihazırda hedeflenen gen bölgesinde çoğalması beklenen bir DNA örneği pozitif kontrol olarak kullanılır. Eğer bu DNA’da çoğalma yoksa o zaman da DNA çoğaltma aşamasında bir sorun vardır.

Evrim Ağacı'ndan Mesaj

Neden Desteğe İhtiyacımız Var?

Aslında maddi destek istememizin nedeni çok basit: Çünkü Evrim Ağacı, bizim tek mesleğimiz, tek gelir kaynağımız. Birçoklarının aksine bizler, sosyal medyada gördüğünüz makale ve videolarımızı hobi olarak, mesleğimizden arta kalan zamanlarda yapmıyoruz. Dolayısıyla bu işi sürdürebilmek için gelir elde etmemiz gerekiyor.

Bunda elbette ki hiçbir sakınca yok; kimin, ne şartlar altında yayın yapmayı seçtiği büyük oranda bir tercih meselesi. Ne var ki biz, eğer ana mesleklerimizi icra edecek olursak (yani kendi mesleğimiz doğrultusunda bir iş sahibi olursak) Evrim Ağacı'na zaman ayıramayacağımızı, ayakta tutamayacağımızı biliyoruz. Çünkü az sonra detaylarını vereceğimiz üzere, Evrim Ağacı sosyal medyada denk geldiğiniz makale ve videolardan çok daha büyük, kapsamlı ve aşırı zaman alan bir bilim platformu projesi. Bu nedenle bizler, meslek olarak Evrim Ağacı'nı seçtik.

Eğer hem Evrim Ağacı'ndan hayatımızı idame ettirecek, mesleklerimizi bırakmayı en azından kısmen meşrulaştıracak ve mantıklı kılacak kadar bir gelir kaynağı elde edemezsek, mecburen Evrim Ağacı'nı bırakıp, kendi mesleklerimize döneceğiz. Ama bunu istemiyoruz ve bu nedenle didiniyoruz.

Destek Ol

American Council on Science

Pozitif kontrollerin yanı sıra, negatif kontroller vardır. Negatif kontroller, testin güvenirliğini etkileyecek dış kontaminantların varlığını belirlemek üzere kullanılır. Negatif kontrollerin, RNA izolasyonunda RNA içermemesi, RNA’dan DNA’ya dönüşmemesi, DNA çoğaltmada ise çoğalma göstermemesi gerekir. Eğer kullanılan materyallere Koronavirüs bulaşmışsa, bu durum negatif kontrollerde ortaya çıkacaktır. Hızlıca bütün kullanılan materyaller değiştirilmelidir.

Sonuç olarak pozitif ve negatif kontrol gruplarıyla PZR yönteminin güvenirliği başarılı bir şekilde arttırılmaktadır. 

PZR Yönteminin Dezavantajları

Dünya Sağlık Örgütü, Koronavirüs test yöntemlerinin çeşitli ülkelerde geliştirilmesi amacıyla referans olduğu çeşitli firma ve grupların tanı metotlarını paylaştı. Bu metotlarda hedeflenecek RNA bölgesinden, kullanılacak protokol süresine kadar her şey detaylı olarak verildi. Bunlarla beraber Dünya Sağlık Örgütü şu an PZR metodunu öneriyor.

Tabii ki PZR testlerinin çeşitli dezavantajları da var:

1. örneklerin toplanması, nakli ve örnekten viral RNA’nın saflaştırılması gibi işlemlerden kaynaklı hata payı olabilir
2. bir analiz 2-3 saatte tamamlanıyor
3. PZR sonuçları yanlış tanı konulmasına sebep olabilir.

Sonuç olarak virüse ait genetik materyalin tanı için yetersiz miktarda olması, örneğin izolasyonu ve naklindeki hatalar gibi sebeplerle PZR yönteminden yanlış sonuçlar çıkabilir. Ama tabii ki yetersiz çalışma olduğu için, bu yöntemin hassaslığı daha fazla çalışmayla anlaşılacaktır. 

İmmünolojik Testler

PZR yönteminde tanı için virüse ait DNA bölgesi saptanırken, immünolojik testler ise kan ve tükürük gibi örneklerdeki virüse ait antijen veya hücrelerin virüse karşı ürettiği antikorların saptanması üzerine kuruludur. Bu testlerin bazıları çıplak gözle saptanırken (örneğin kan grubu testleri), bazıları ise floresan bir boya veya enzimatik bir reaksiyon ile belli bir cihaz altında gözlemlenmektedir.

Genel olarak bu testler laboratuvar testleri ve hızlı testler olarak ikiye ayrılabilir. Laboratuvar testlerinde saptanması istenen moleküle spesifik olarak tasarlanan molekül, genellikle bir reaksiyon ile ölçülebilir ışıma veya renk verir. Bu ışıma veya renk, bunları ölçebilecek cihazlarda ölçülerek hedeflenen molekülü -miktarını dahi- saptayabilir. Koronavirüsün saptanmasında bu testler de yaygın olarak kullanılmıştır. Detaylı araştırmak isteyenler için, bu yöntemin adı enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA)’dir.

First Response!

Hızlı testlerde ise saptanması istenen moleküle spesifik olarak tasarlanmış molekül bir kağıt şeride aktarılır. Örneğin burada koronavirüs saptanması için kullanılan Antikor M’yi ele alalım. Örnek damlatılarak uygulandıktan sonra kağıt, sünger etkisiyle örneği emer. Ardından örnek sıvı ortamın kağıda emilimi ile harekete geçer ve Antikor M, onu tanımak üzere tasarlanmış moleküllerin olduğu bölgede bu moleküllere bağlanır. Örneğin oluşturduğu akışla birlikte bu Antikor M ve bağlandığı molekül harekete geçer.

Kağıt şerit üzerinde 2 bölge vardır: Test bölgesi ve kontrol bölgesi. Örnekte Antikor M varsa, kağıttaki moleküllere bağlanır ve test bölgesinde renk verir. Eğer yoksa, bağlanmaz ve test bölgesinde renk vermez. Kontrol bölgesinde ise Antikor M olsun veya olmasın ona bağlanacak moleküllerin bir kısmı test bölgesine gider. Eğer kontrol bölgesinde renk yoksa, testte sorun vardır. Hamilelik testi benzer mekanizma ile çalışır. Test bölgesi birinci çizgi, kontrol bölgesi ikinci çizgidir. Korona testine uyarlarsak, 2 çizgi olan örnek korona pozitif, tek çizgili olan örnek ise korona negatif olacaktır. 

İmmünolojik Testlerin Dezavantajları

Yukarıda bahsedilen PZR’nun dezavantajları ve yaygın uygulanamamasından kaynaklı, çeşitli gruplar hızlı tanıya imkan sağlayabilecek immünolojik testler üzerinde çalışmaktadır. Fakat bu hızlı testlerin dezavantajı, doğruluk oranıdır. Örneğin Li ve arkadaşlarının Şubat 2020'de gerçekleştirdiği bir çalışmada, kandan 15 dakikada tanı koyan bir immünolojik test geliştirdiklerini gözlemliyoruz. Fakat bu testin doğruluk oranı %88.66’dır. Buna benzer dezavantajlara karşın çeşitli çalışmalarda bu immonolojik testlerin piyasaya çıktığını ve bazılarının çeşitli kuruluşlardan onay aldığını da gözlemliyoruz. 

Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi, Acil Durum Kullanım Yetkileri kapsamında COVID-19 ile mücadelede belli bir taslak ile tanı kitlerine hızlı izin getirdiğini duyurdu. Bu listede sadece 20 izin görüyoruz ve bu izinleri alan firmaların tamamı tanı alanında kendini kanıtlamış global firmalardır.

Bunun dışında bütün dünyada özellikle CE belgelendirmesi yaparak kit geliştiren firmaların daha geniş listesi de bulunmaktadır. Bu listede yerli Anatolia Geneworks firması da (başka yerli firmalar bulabilirsiniz, gözümüzden kaçmış olabilir) yer almaktadır.

Ortak olarak bütün firmaların test kitlerini incelediğimizde genellikle görülen farklılık hedefledikleri DNA veya antijen/antikor bölgeleri ve kullandıkları kontrol gruplarıdır. Bu firmaların kitlerinde her bilgi detaylı olarak verilmektedir. Sonuç olarak PZR testlerinde de, hızlı immünolojik testlerde de kontrollere rağmen çeşitli yanlış tanı sonuçları gelebilmektedir. Bir kitin güvenirliliğini belirleyen kıstaslar, kullandığı kontrol grupları ve hedeflenen DNA veya molekül bölgeleridir. Tanı alanındaki global firmaların kullandığı kontrol gruplarının ve hedeflenen gen bölgelerinin birden fazla olduğunu gözlemliyoruz. Bu kitlerin içerikleri iyi bir tanı testinin nasıl olması gerektiğini hemen hemen ortaya koyuyor.

Agora Bilim Pazarı

Hayvani Rekorlar Kitabı

EN YÜKSEĞE ZIPLAYAN HAYVAN HANGİSİ? 
PEKİ, EN ZEHİRLİ YILAN?
EN ÇOK TERLEYEN YA DA EN İYİ GECE GÖRÜŞÜNE SAHİP HAYVANI MERAK EDİYOR MUSUNUZ?
VEYA EN ÇOK ÇİŞ YAPMA REKORUNU ELİNDE TUTANI?

Doğa, aklınıza gelebilecek en tuhaf şeylerde ustalaşmış olağanüstü hayvanlarla dolu.
Hava durumunu tahmin edebilen balık, fıstık ezmesi gibi kokan kurbağa, mavi balinadan daha uzun solucan ve en az bunlar kadar ilginç onlarca hayvan.
Çok sayıda dile çevrilen Hayvani Rekorlar Kitabı, olağanüstü çizimler eşliğinde bizleri dünyanın en marifetli hayvanlarıyla tanıştırıyor.

Devamını Göster

₺389.00

Satın Al Tüm Ürünler

• Dış Sitelerde Paylaş

5 Dakikada Test!

Son olarak geçen hafta, Abbott tarafından -yukarıda bahsedilen PZR metoduna benzer mekanizmayla çalışan- yeni bir metot ile 5 dakikada tanı koyan bir kit duyuruldu. Negatif örnekleri ise 13 dakika içerisinde saptayan bu test, geçen hafta Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi tarafından onay aldı. Abbott günlük 50.000 test kiti üretme kapasitesine sahip olduklarını da açıkladı.

Bu testin doğruluk oranının PZR kadar olmayacağı tahmin ediliyor; fakat bunu söylemek için erken. Daha fazla çalışması yapılması gerekiyor. Ama şu an testlere bu kadar çok ihtiyaç varken böyle bir gelişmenin olması umut verici.

2000 yılında Notomi ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu yöntemin adı loop-mediated isothermal amplification (LAMP)’dır. Kabaca bu yöntemin hızlı immünolojik testlere göre avantajı koronavirüs enfeksiyonunun her aşamasında tanı imkanı sağlayabilmesidir. Bu yöntemin detayına bu yazıda girilmeyecek; fakat kısaca tanıtım videosunu inceleyebilirsiniz: