Deneysel Çalışmaların Vazgeçilmezleri: Hücre Hattı Nedir?
Memelilerin bilimsel deneylerde kullanılmasının mümkün olduğunca kısıtlanması gerekliliği, biyomedikal çalışmaların farklı pek çok alanında hücre kültürlerinin geliştirilmesi ve kullanılmasına yol açmıştır. Hücre kültürleri mikrobiyolojide özellikle virüslerin üretilmesi ve tanımlanması, virüs aşılarının üretimi amacıyla kullanılmaktadırlar. Yeni yüzyılda ise kanser araştırmalarının hız kazanması ile özellikle kanser ilaçlarının geliştirilmesinde, etkilerinin saptanmasında hücre kültürleri özellikle büyük önem kazanmıştır.
İlk defa 1951 yılında Baltimore’da (ABD) servikal kanser nedeniyle takip edilen Afrika kökenli Amerikalı bir hastanın kanser dokularının laboratuvarda kültürü başarılabilmiştir. Henrietta Lack adındaki hasta kanserin yayılması sonucu ölmüş ancak ölümsüz hücrelerinin kültürü adına atfen HeLa adı ile dünya genelindeki laboratuvarlara talep nedeniyle dağıtılmıştır. Bu olayın ilginç diğer yanı ailesinin uzun yıllar bu hücrelerin tüm dünya genelinde yaşamaya devam ettiğinden haberdar olmamalarıdır. Kanser hücrelerinin ölümsüz olması ve çok kolay üretilebilmeleri çalışmalarda hücre kültürü gerektiren araştırmalara hız kazandırmıştır. Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection, ATCC) ve Avrupa Hücre Kültür Koleksiyonu (European Collection of Cell Culturu, EACC) hücreler için ana kaynaklardır ve 80 farklı türe ait 4000’den fazla hücre kültürünü bünyesinde bulundurmaktadır.
Hücre Hatları
Hücre hattı nedir?
Hücre kültürü bitki veya hayvanlardan ekstrakte edilen hücrelerin daha sonrasında yapay bir ortamda büyütülmesi olarak adlandırılmaktadır. Hücreler dokudan direk veya enzimatik ve mekanik yöntemlerle parçalara ayrılarak kültüre alınabilirler. Primer hücre kültürü hücrelerin dokudan izole edildiklerinden sonraki aşamayı ve uygun koşullar altında hücre çoğalması için ortamdaki tüm ulaşılabilir substratları kullanmasını ifade eder. Bu aşamada hücrelerin büyümesini devam etmesi için yeni medium ve daha fazla alan içeren yeni kaba aktarılması yoluyla alt kültüre alınması gereklidir. İlk alt kültürden sonraki primer kültür hücre hattı veya alt klon olarak bilinen hale dönüşür. Primer kültürden elde edilen hücre hatları sınırlı yaşam ömrüne sahiptir ve en yüksek büyüme kapasitesine sahip predominant hücrelerden dolayı pasajlandıkça populasyon genotipik ve fenotipik olarak homojen hale gelir.
Normal hücreler çoğunlukla çoğalma kabiliyetlerini kaybetmeden önce sınırlı sayıda bölünme yeteneğine sahiptir. Bu durumu genetik olarak belirlenmiştir ve hücresel yaşlanma olarak bilinmektedir. Bu yüzden bu hücre hatlarının sınırlı olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, bazı hücre hatları spontan, viral ya da kimyasal uyarılma yoluyla transformasyon süreci sırasında ölümsüz hale gelmektedir. Eğer sınırlı hücre hattı transformasyona uğrar ve sınırsız sayıda bölünme yeteneği kazanırsa, sürekli hücre hattı haline gelir.
Maya hücreleri, ökaryotik gen fonksiyonlarının çalışılmasında genetik model olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır fakat biriken veriler çoğu insan geninin mayalarda temsil edilmediğini göstermektedir. Önemli bir şekilde, apoptozis, yaşlanma, doku spesifik farklılaşma ve onkogenik transformasyon gibi hücresel süreçlerin mayalarda doğru karşılığı yoktur. Memeliler ve diğer model organizmalar arasındaki filogenetik uzaklık yüzünden sıklıkla insanlardaki bu sistemler için sonuç çıkarmak mümkün olmamaktadır. Bu nedenle, yukarıda bahsedilen etkiler en doğru olarak memeli hücrelerinde gözlenebilir.
Hücre Hattı Kültürü
Hücre kültür türleri
Süspansiyon hücre kültürü; süspansiyon hücreler ortamda asılı durmuş şekilde büyürler. Bu hücreler, kültür şişesine bağlanmadan hayatta kalabilir ve çoğalabilirler. Kan, dalak, kemik iliği ve özellikle tam gelişmemiş hücreler süspansiyon şeklinde büyüme eğilimindedirler. Süspansiyon içindeki hücreler küçük toplar gibi görünürler. Süspansiyon büyümenin avantajı çok sayıda hücreyi büyütebilmek ve kolayca kültürden toplayabilmektir.
Yapışkan hücre kültürü; yapışkan hücreler tek tabaka halinde, yüzeye tutunarak büyürler. Ektodermal ve endodermal embryonik hücre tabakalarından türeyen hücreler yapışkan bir şekilde büyüme eğilimindedirler. Bunlar, fibroblast ve epitel hücrelerini içerir. Yapışkan hücreler değişik şekillerde olabilirler, fakat genellikle düzdürler. Süspansiyon halde büyütülen aynı hücreler yuvarlak olabilirler. Yapışkan büyümenin avantajı, hücreleri lamel gibi yüzeylere yayabilmek ve yapıştırabilmektir. Bu özellikler, mikroskop, hibridizasyon ve fonksiyonel testlerde kolaylık sağlar.
Hücre kültür ortamı ve kültür şartları
Gerekli besinleri, büyüme faktörlerini ve hücre büyümesi için gerekli hormonları sağladıklarında dolayı kültür ortamı kültür çevresinin en önemli bileşenidir. İlk hücre kültürü deneyleri doku ekstraktları ve vücut sıvılarından elde edilen kültür ortamı ile gerçekleştirilmesine rağmen kültür ortamında standartizasyona ihtiyaç vardır. Kültür ortamları destek olarak kullanılan serum ihtiyacına göre Temel medium, Serum-azaltılmış medium ve Serumsuz medium olmak üzere üç sınıfa ayrılırlar. Serum; büyüme, adezyon faktörleri, hormonlar, lipidler ve mineral kaynağı olarak temel besiyerinde ki kültür hücreleri için son derece önemlidir. Ek olarak serum hücre membranı geçirgenliğini düzenler ve lipidler, enzimler, mikrobesinler ve eser elementlerin taşıyıcısı olarak görev alır. Bununla birlikte serum kullanımının yüksek maliyet, standartizasyon problemleri, spesifiklik, değişkenlik ve büyümenin ve/veya hücresel fonksiyonların uyarılması-baskılanması gibi istenmeyen etkilere yol açması gibi dezavantajları vardır.
- Kaostan Doğan Yeni Hücre Düzeni: Yoğuşma Bölgelerinin Keşfi Sayesinde, Yaşamın Kaotik Kimyası Baştan Keşfediliyor!
- Bakteriyografi ve Mikrobiyoloji Sanatı: Bakterilerden Portreler Yapmak...
- Genetik Mühendisliği ile Kök Hücrelerden Mini Karaciğerler Üretmek ve Bunları Kullanarak, Karaciğer Hastalığı Olan Farelerin Ömrünü Uzatmak Mümkün!
Temel medium: Hücre hatlarının büyük çoğunluğu amino asitler, vitaminler, inorganik tuzlar ve glukoz gibi karbon kaynakları içeren temel besiyeri içinde iyi gelişirler. Fakat temel besiyeri içeriği serum ile desteklenmelidir.
Serum azaltılmış medium: Hücre kültürü deneylerinde istenmeyen etkileri azaltmanın bir yolu serum azaltılmış medium kullanımıdır. Serum azaltılmış medium temel medium içeriğinin besinler ve hayvan kaynaklı faktörlerle zenginleştirilmesiyle oluşur. Bu durum serum ihtiyaç miktarının azalmasına sebep olur.
Serumsuz medium: Serumsuz medium (Serum-free media, SFM) serum yerine uygun besinsel ve hormonal içeriklerin formulasyona koyulmasıyla hayvan serumundan doğacak durumların önüne geçer. Serumsuz medium formulasyonları çoğu primer kültür ve hücre kültürler için vardır. Serumsuz medium kullanımının büyük avantajlarından biri uygun büyüme faktörlerinin kombinasyonuyla kültür ortamını seçici hale getirerek spesifik hücre tiplerinin seçilebilmesine olanak sağlamasıdır.
Aslında maddi destek istememizin nedeni çok basit: Çünkü Evrim Ağacı, bizim tek mesleğimiz, tek gelir kaynağımız. Birçoklarının aksine bizler, sosyal medyada gördüğünüz makale ve videolarımızı hobi olarak, mesleğimizden arta kalan zamanlarda yapmıyoruz. Dolayısıyla bu işi sürdürebilmek için gelir elde etmemiz gerekiyor.
Bunda elbette ki hiçbir sakınca yok; kimin, ne şartlar altında yayın yapmayı seçtiği büyük oranda bir tercih meselesi. Ne var ki biz, eğer ana mesleklerimizi icra edecek olursak (yani kendi mesleğimiz doğrultusunda bir iş sahibi olursak) Evrim Ağacı'na zaman ayıramayacağımızı, ayakta tutamayacağımızı biliyoruz. Çünkü az sonra detaylarını vereceğimiz üzere, Evrim Ağacı sosyal medyada denk geldiğiniz makale ve videolardan çok daha büyük, kapsamlı ve aşırı zaman alan bir bilim platformu projesi. Bu nedenle bizler, meslek olarak Evrim Ağacı'nı seçtik.
Eğer hem Evrim Ağacı'ndan hayatımızı idame ettirecek, mesleklerimizi bırakmayı en azından kısmen meşrulaştıracak ve mantıklı kılacak kadar bir gelir kaynağı elde edemezsek, mecburen Evrim Ağacı'nı bırakıp, kendi mesleklerimize döneceğiz. Ama bunu istemiyoruz ve bu nedenle didiniyoruz.
Normal memeli hücre hatlarının çoğu pH 7.4’te iyi gelişirler ve farklı hücre soylarında çok az değişiklik olabillir. Bununla birlikte transforme hücre hatları hafif asidik ortamda (pH 7.0-7.4) daha iyi büyüme gösterirler ve bazı normal fibroblast hücre hatları hafif bazik ortamı (pH 7.4-7.7) tercih ederler.
Büyüme medium’u pH’ı kontrol eder ve kültürdeki pH değişimlerine karşı hücreler tampon oluşturur. Genellikle organik (örneğin HEPES) veya CO2-bikarbonat tamponlar kullanılır. Medium’un pH’ı çözünmüş karbondioksit (CO2) ve bikarbonat (HCO3-) dengesine bağlıdır ve atmosferik CO2 değişimi medium pH’ını değiştirebilir. Bununla birlikte CO2-bikarbonat tamponlar kullanılırken dışarıdan CO2 kaynağı kullanımı gereklidir.
Hücre kültürü optimal sıcaklığı, hücreleri izole edildiği konakçının büyük oranda vücut sıcaklığına bağlıdır ve anatomik varyasyonlara göre az derecede değişiklikler olabilir (örneğin deri sıcaklığı iskelet kası sıcaklığına göre daha düşük olabilir). Hücre kültürünü aşırı ısıtma az ısıtmaya göre daha ciddi bir problemdir, bu yüzden inkübatör sıcaklığı optimal sıcaklığın çok az altına ayarlanabilir. Çoğu insan ve memeli hücre hatları optimal büyüme için 36-37oC sıcaklığa ihtiyaç duyar.
Kültür Edilen Hücrelerin Gözlemlenmesi
Hücreler, yeni şişelere her transfer edileceklerinde veya deneyler için her kullanılacaklarında mikroskopik ve makroskopik olarak gözlenmelidir. Eğer hücreler sağlıklı değilse, deneyler de yolunda gitmez. Hücre kültürü şişesi inkübatörden çıkarıldığında şunlar dikkatle incelenmelidir:
- Ortamın rengi: Birçok besiyeri ortamında asidik koşullarda sarıya, bazik koşullarda ise mora dönüşen pH indikatörü vardır. Fazlasıyla asidik, ya da bazik ortam, kontaminasyonun, fazla büyümüş kültürün, ölükültürün ya da hatalı CO2 dağılımının göstergesi olabilir.
- Ortamın bulanıklığı kontaminasyonu veya aşırı büyümüş kültürü haber verir.
Hücreler, şişede veya petri kabında büyütülüyorsa invert mikroskopta 40X’te gözlendikten sonra deneylerde kullanılmalıdır. Yapışkan hücreler, yüzeyde düz bir tabaka şekinde yayılmış olmalıdır. Süspansiyon hücreler ise küreseldir, fakat bazı hücreler yüzeye tutunmuş olabilir.
Kültürdeki hücrelerin morfolojilerinin düzenli olarak incelenmesi başarılı hücre kültürü deneyleri için temeldir. Ek olarak hücrelerin sağlık durumunu doğrulamak, her seferinde hücreleri göz ve mikroskopla incelerken kontaminasyon sinyallerininin erken safhada belirlenmesini ve laboratuardaki diğer kültürlere yayılmasının engellemesini sağlar. Nükleus çevresindeki granüler yapıları içeren bozulma işaretleri kültürün kontaminasyonu, hücre hattının yaşlanması, mediumda toksik maddelerin bulunması veya kültürün medium değişimine ihtiyaç duyduğunun işaret eden sebeplerden kaynaklanabilir. Bozulmalara izin vermek geri dönüşümsüz etkilere yol açar.
Hücre Morfolojileri
Çoğu memeli kültür hücreleri morfolojilerine göre 3 temel kategoriye ayrılabilir.
- Fibroblastik (veya fibroblast benzeri) hücreler bipolar veya multipolardırlar ve uzamış şekile sahiptiler. Substrata bağlı olarak büyürler.
- Epitel benzeri hücreler poligonaldır, daha düzgün boyutlu şekilleri vardır. Ayrık kümeler halinde gelişirler.
- Lenfoblast benzeri hücreler küresel şekillidirler ve yüzeye ihtiyaç duymadan süspansiyon da büyüyebilirler.
Bu temel kategorilere ek olarak belirli hücreler konakda özelleştikleri spesifik morfolojik karakterleri gösterirler. Nöronal hücreler farklı şekillerde ve büyüklükte olabilirler fakat iki morfolojik kategoriye ayrılırlar. Tip I sinyalleri uzunluğu boyunca ileten uzun aksonlu olanlar ve tip II aksonsuz olanlar. Tipik nöron hücreleri dendrit denilen hücre gövdesinden uzanmış dallar şeklinde uzantılar gösterirler.
Deney İçin Uygun Hücre Hattının Seçilmesi
Deneyler için uygun hücre hattı seçilirken aşağıdaki kriterler göz önünde bulundurulmalıdır.
- Tür: İnsan olmayan ve primat olmayan hücre hatlarının genellikle daha az biyogüvenlik kısıtlamaları vardır ama deneyler spesifik tür kültürünü kullanıp kullanmayacağınızı belirleyecektir.
- Fonksiyonel karakteristik: Deneylerinizin amacı nedir? Örneğin, karaciğer ve böbrekten elde edilmiş hücre hatları toksisite tesleri için daha uygundur.
- Sınırlı veya sürekli: Sınırlı hücre hatlarını seçmek doğru fonksiyonlar açığa çıkması için daha fazla seçenek verir, bununla birlikte sürekli hücre hatlarını çoğaltmak ve sürdürmek sıklıkla daha kolaydır.
- Normal veya transforme olmuş: Transforme hücre hatları genellikle artmış büyüme oranı ve yüksek kaplama etkinliği vardır, süreklidirler ve daha az medium kullanma ihtiyacına sahiptir, fakat genetik transformasyon yoluyla fenotipte kalıcı değişiklikler meydana gelmiştir.
- Büyüme şartları ve karakteristik: Beklediğiniz büyüme oranı, yoğunluk, klonlama verimi ve süspansiyonda büyüme yeteneği nedir? Örneğin, yüksek miktarda rekombinant protein ekpresyonu için hızlı büyüme oranına sahip ve süspansiyonda büyüme yeteneğine sahip hücre hattını seçebilirsiniz.
- Diğer kriterler: Sınırlı hücre hattı kullanıyorsanız ulaşabileceğiniz yeterince stok var mı? Hücre hattı iyi şekilde karakterize edilmiş mi veya doğrulamayı kendiniz yapabilecek misiniz? Anormal hücre hattı kullanıyorsanız kontrol olarak kullanabileceğiniz eşdeğer bir hücre hattı var mı? Hücre hattı stabil mi? Eğer değilse klonlaması ne kadar kolay ve deneyler için yeterli donmuş stoklar üretilebilir?
Kullanılabilir Hücre Hattı Türleri
Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection, ATCC) ve Avrupa Hücre Kültür Koleksiyonu (European Collection of Cell Culturu, EACC) hücreler için ana kaynaklardır ve 80 farklı türe ait 4000’den fazla hücre kültürünü bünyesinde bulundurmaktadırlar.
Hücre hatları elde edildikleri doku tipi (deri, kan vb.), hücre tipi (fibroblast, epitelyal vb.), hastalık modeli (kanser hücre hatları, genetik hastalıklar vb.) gibi kriterler göz önüne alındığında çok çeşitli şekillerde sınıflandırılabilirler.
Hastalık modeline göre;
1. Kanser Hücre Hatları
- Genetik mutasyona sahip hücre hatları
- APC: Mutasyonları β-katenin kaybına sebep olur, değişmiş hücre göçü ve kromozom instablitesi ile ilişkilidir. Kolon, akciğer ve deri kanserlerin de rol oynar.
- BRAF: Mutasyonları aşırı hücre çoğalması ve hayatta kalma ile ilişkilidir, büyüme faktörlerine bağımsız olmayı sağlar. Doğum defektlerinde, tiroid ve cilt kanserlerinde yaygındır.
- EGFR: Onkogendir, antikanser ilaçların hedef noktasıtıdır.
- CTNNB1: Onkogen olarak fonksiyon yapar ve mutasyonları ile kanserde önemli rol oynar.
- PIK3CA: Fosfatidil inositol 3-kinaz (PIK3CA) Sınıf I PI3K p110α katalitik altünitesini kodlar, kolon, akciğer, ovaryum ve göğüs kanserlerinde rol oynar.
- PTEN: Bu gendeki mutasyonlar prostat, beyin, cilt ve göğüs kanserinide içeren çeşitli kanser türleriyle ilişkilendirilmiştir.
- TP53: Önemli bir tümör süpresör transkripsiyon faktörü olan p53’ü kodlar, DNA hasarına hücresel cevabın verilmesi ve diğer genomik anomalilerde önemli rol oynar.
- Doku tipine göre (Beyin, akciğer, kolon kanseri gibi)
2. Tümör/Normal Doku eşleştirilmiş hücre hatları
Aynı hastadan elde edilmiş tümör doku kaynaklı normal ve metastatik hücre hatları.
3. Genetik Hastalıklar
- CFTR hücre hatları
- Down sendromu hücre hatları
- Ehlers-Danlos Sendromu hücre hatları
- Kalıtsal Sferositosis hücre hatları
- Lesch-Nyhan Sendromu hücre hatları
- Marfan Sendromu hücre hatları
4. hTERT Ölümsüz Hücre Hatları
İnsan primer hücre hatlarının hTERT ile transfeksiyonu kromozomların uçlarında telomerlerin korunmasına ve uzamasına sebep olur. Çoğu durumda, hTERT’in ekspresyonunun uyarılması replikatif stres ile yaşlanmayı ve aşırı büyüme krizini baskılar, etkili bir şekilde ölümsüzlüğe yol açar. Bazı vakalarda, özel bir hücre tipini ölümsüz hale getirmek için birden fazla hücreyi ölümsüz hale getirecek ajan gerekebilir. Örneğin hücre hatları bu ajanlardan bir veya daha fazlası ile ölümsüz hale getirilebilir: viral genler kodlayanlar simian virus 40 (SV40) büyük T antijeni ve insan papilloma virus-16 (HPV-16) E6/E7) veya viral olmayan (Cdk-4 ve Bmi-1) onkoproteinler.
- Bronşial epitelyal hücreler
- Kondrosit fibroblast hücreleri
- Dermal microvasküler hücreler
- Endometrial fibroblast hücreleri
- Renal epitelyal hücreler
- Deri fibroblast hücreleri
- Pankreas kanal hücreleri
Not: Bu yazıya katkılarından ötürü Mehmet Ali Erkoç'a teşekkür ederiz.
doi: 10.47023/ea.bilim.20
İçeriklerimizin bilimsel gerçekleri doğru bir şekilde yansıtması için en üst düzey çabayı gösteriyoruz. Gözünüze doğru gelmeyen bir şey varsa, mümkünse güvenilir kaynaklarınızla birlikte bize ulaşın!
Bu içeriğimizle ilgili bir sorunuz mu var? Buraya tıklayarak sorabilirsiniz.
Soru & Cevap Platformuna Git- 12
- 5
- 5
- 3
- 3
- 1
- 1
- 1
- 0
- 0
- 0
- 0
- J. R. Masters. (2002). Hela Cells 50 Years On: The Good, The Bad And The Ugly. Nature Reviews Cancer, sf: 315-319. | Arşiv Bağlantısı
- J. R. Masters. (2000). Human Cancer Cell Lines: Fact And Fantasy. Nature Reviews Molecular Cell Biology, sf: 233-236. | Arşiv Bağlantısı
- S. Coecke, et al. (2005). Guidance On Good Cell Culture Practice: A Report Of The Second Ecvam Task Force On Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals, sf: 261-287. | Arşiv Bağlantısı
- G. Stacey. (2006). Primary Cell Cultures And Immortal Cell Lines. eLS. | Arşiv Bağlantısı
- G. Kaur, et al. (2012). Cell Lines. Spermatogenesis, sf: 1-5. | Arşiv Bağlantısı
- J. R. Masters. (2002). False Cell Lines: The Problem And A Solution. Cytotechnology, sf: 69-74. | Arşiv Bağlantısı
- G. C. Buehring, et al. (2004). Cell Line Cross-Contamination: How Aware Are Mammalian Cell Culturists Of The Problem And How To Monitor It?. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, sf: 211-215. | Arşiv Bağlantısı
- A. Capes-Davis, et al. (2010). Check Your Cultures! A List Of Cross-Contaminated Or Misidentified Cell Lines. International Journal of Cancer, sf: 1-8. | Arşiv Bağlantısı
Evrim Ağacı'na her ay sadece 1 kahve ısmarlayarak destek olmak ister misiniz?
Şu iki siteden birini kullanarak şimdi destek olabilirsiniz:
kreosus.com/evrimagaci | patreon.com/evrimagaci
Çıktı Bilgisi: Bu sayfa, Evrim Ağacı yazdırma aracı kullanılarak 09/12/2024 19:57:40 tarihinde oluşturulmuştur. Evrim Ağacı'ndaki içeriklerin tamamı, birden fazla editör tarafından, durmaksızın elden geçirilmekte, güncellenmekte ve geliştirilmektedir. Dolayısıyla bu çıktının alındığı tarihten sonra yapılan güncellemeleri görmek ve bu içeriğin en güncel halini okumak için lütfen şu adrese gidiniz: https://evrimagaci.org/s/20
İçerik Kullanım İzinleri: Evrim Ağacı'ndaki yazılı içerikler orijinallerine hiçbir şekilde dokunulmadığı müddetçe izin alınmaksızın paylaşılabilir, kopyalanabilir, yapıştırılabilir, çoğaltılabilir, basılabilir, dağıtılabilir, yayılabilir, alıntılanabilir. Ancak bu içeriklerin hiçbiri izin alınmaksızın değiştirilemez ve değiştirilmiş halleri Evrim Ağacı'na aitmiş gibi sunulamaz. Benzer şekilde, içeriklerin hiçbiri, söz konusu içeriğin açıkça belirtilmiş yazarlarından ve Evrim Ağacı'ndan başkasına aitmiş gibi sunulamaz. Bu sayfa izin alınmaksızın düzenlenemez, Evrim Ağacı logosu, yazar/editör bilgileri ve içeriğin diğer kısımları izin alınmaksızın değiştirilemez veya kaldırılamaz.