DNA Dizileme Yöntemleri: Genler Nasıl Dizilenir? Yeni Nesil DNA Sekanslama Yöntemleri Nelerdir?

DNA Dizileme Yöntemleri: Genler Nasıl Dizilenir? Yeni Nesil DNA Sekanslama Yöntemleri Nelerdir?
Ayşegül Şenyiğit Özdil Editör Ayşegül Şenyiğit Özdil  YaseminAkın 2. Editör Yasemin Akın
21 dakika
1,852 Okunma Sayısı
Notlarım
Reklamı Kapat

DNA, canlıların bütün genomik verilerini içerisinde bulunduran, hücrelerin "yönetici molekülü"dür. DNA, içerisinde bulunan bilgileri (genleri) RNA’lar aracılığıyla protein şeklinde ifade eder. DNA’nın sekanslanması (dizilenmesi), DNA’daki nükleotit dizilimlerini çözmek, yani aslında DNA’yı okumak anlamına gelir.

Genomların sekanslanması, DNA’nın yapısının 1953’de Franklin, Watson ve Crick tarafından aydınlatılmasının ardından, biyologlar tarafından üstünde çalışılan bir konu olmuştur. Özellikle insan genomunun sekansının aydınlatılması, genetik hastalıkların tedavi edilmesine giden sürecin ilk basamağı olduğu için ayrı bir önem kazanmıştır.

Yeni nesil yöntemleri incelemeden önce ilk olarak temel yöntemlerden ve esasında yeni nesil yöntemlere temel fikirlerini veren metotlardan bahsetmek daha doğru olacaktır.

Birincil Nesil Sekanslama Yöntemleri

Maxam-Gilbert Metodu

1970’li yıllarda iki-boyutlu kromatografi yöntemlerinin ilerlemesiyle protein ve DNA’ları kütle, büyüklük, yük gibi özelliklere bağlı olarak ayırt etmek ve saflaştırmak çok daha kolay bir hale gelmiştir. DNA’nın sekanslanması ilk olarak 1976-1977 yıllarında, Harvard Üniversitesi’nden Allan Maxam ve Walter Gilbert tarafından Maxam-Gilbert adı verilen bir yöntemle gerçekleşmiştir.

Reklamı Kapat

Bu yöntemde DNA zincirinin 5’ ucunda bulunan fosfat grubunun radyoaktif fosfat (32P) ile işaretlenir ve DNA saflaştırılır. G, A+G, C ve C+T nükleotidlerinin muamelesini içeren 4 farklı kimyasal reaksiyon seti şeklinde, bu nükleotitlerin bulundukları DNA konumundan kesikler oluşturulur. Belirli modifikasyonları sağlayan enzimlerin farklı konsantrasyonlarda kullanılmasıyla her DNA molekülü başına az sayıda modifikasyon oluşması sağlanır. Modifiye olmuş DNA parçaları kesilerek elektroforeze sokulur ve 4 farklı reaksiyonu ifade eden 4 farklı kolondaki bantlara göre aşağıdan yukarıya yani kısa zincirlerden uzun zincirlere doğru okuma yapılır.

Maxam-Gilbert metodu ile muamele edilmiş DNA fragmentinin elektroforez sonucu. Bahsedildiği üzere Maxam-Gilbert metodunda nükleotitleri ayırt etmek için 4 farklı enzim muamelesi uygulanır. Dikkat ettiyseniz bazı bazlar için iki farklı muamele varken (G ve C) bazıları için (A ve T) özgül bir muamele yoktur. Örneğin sitozin hem hidrazin hem de hidrazin+tuz reaksiyonuna tepki vermektedir, eğer incelenen nükleotit yalnızca hidrazin'e tepki verseydi bu bazın Timin olduğu söylenebilirdi.
Maxam-Gilbert metodu ile muamele edilmiş DNA fragmentinin elektroforez sonucu. Bahsedildiği üzere Maxam-Gilbert metodunda nükleotitleri ayırt etmek için 4 farklı enzim muamelesi uygulanır. Dikkat ettiyseniz bazı bazlar için iki farklı muamele varken (G ve C) bazıları için (A ve T) özgül bir muamele yoktur. Örneğin sitozin hem hidrazin hem de hidrazin+tuz reaksiyonuna tepki vermektedir, eğer incelenen nükleotit yalnızca hidrazin'e tepki verseydi bu bazın Timin olduğu söylenebilirdi.
NCBI

Bu yöntem, sonradan popülerleşecek olan ve aşağıda değineceğimiz Sanger’in makalesinden iki yıl sonra bulunmuş olsa da, kısa sürede popüler hale gelmişti; çünkü Sanger’da olduğu gibi DNA kalıbının çoğaltılmasına ihtiyaç duymadan, tek bir DNA’yı işaretleyip kullanmayı mümkün kılıyordu. Ancak Sanger’in, yöntemini zincir sonlandıran terminatörler ile destekleyip okumanın daha otonom ve kolay olması için boyalar eklemesi, 4 farklı reaksiyon kullanan bu yöntemin terk edilmesine sebep olmuştur.

Sanger Metodu

Zincir sonlandırma metodu, bu yöntemi bulan bilim insanına ithafen, Sanger Metodu olarak da adlandırılır ve temelde zincirin sentezini sonlandırmaya yarayan dideoksinükleotitler (ddNTP) kullanılmasına dayanır. Dideoksinükleotitlerin normal deoksinükleotitlerden farkı, 3’OH grubu yerine 3’H grubu içermeleridir. DNA’da iki nükleotitin bağlanması ile oluşan fosfodiester bağları, oluşmak için 5’P ve 3’OH grupları gerektirir. Zincirin sonuna eklenen nükleotit 3’OH grubu içeren normal bir dNTP yerine bir ddNTP türevi ise, bu nükleotidin sonrasında gelen bir nükleotit ile bağ kurması mümkün olmayacaktır ve zincir sentezi sonlanacaktır.

Sanger metodunda bu sona gelen ddNTP’ler floresan bir boya ile işaretlenerek (ddATP, ddTTP, ddGTP ve ddCTP’nin her biri için farklı bir renk atanır.) sekanslanması amaçlanan çok sayıda tek iplikli DNA’nın ve DNA sentezini yapacak polimerazın bulunduğu bir ortama aktarılır. Sentez gerçekleştiği sırada bir DNA fragmentine eklenen ddNTP, sentezi farklı baz konumlarında durdurur ve türüne göre bir renkte floresan ışıma yapan farklı uzunluktaki DNA zincirlerinin oluşmasını sağlar. Bu ışımanın dalga boyu bir detektör ve bilgisayar tarafından algılanır ve dalga boyuna göre nükleotit türü belirlenmiş olur. Flüoresan boyaların kullanımından önce farklı bir dideoksinükleotid işaretleme yöntemi, radyoaktif işaretleme olmuştur ve flüoresan tekniğinin aksine 4 farklı jel bandında, işaretlenmiş 4 farklı nükleotid tipini içerir.

Evrim Ağacı'ndan Mesaj

Sanger yönteminde kullanılan iki farklı görüntüleme yöntemi. Sanger yöntemi temelinde binlerce aynı fragment kopyasının farklı uzunluklarda sentezinin durdurulup bu fragmentlerin ayrılması esasına dayanır. Bütün fragmentler son ddNTP'si ya renk koduyla ya da radyografi ile görüldüğünden, kısa fragmentten uzuna giderken son nükleotitlerin okunması aynı zamanda sekansın da okunmasını sağlayacaktır. Üstteki yöntem otonomdur ve nükleotitlere farklı renkler atayarak ayırt edilmesini sağlar, alttaki yöntem ise otoradyografi sonucudur ve okunurken aşağıdan yukarıya okuma yapılmalıdır. (Bu şekilde jel yan döndürüldüğü için soldan sağa okunur.)
Sanger yönteminde kullanılan iki farklı görüntüleme yöntemi. Sanger yöntemi temelinde binlerce aynı fragment kopyasının farklı uzunluklarda sentezinin durdurulup bu fragmentlerin ayrılması esasına dayanır. Bütün fragmentler son ddNTP'si ya renk koduyla ya da radyografi ile görüldüğünden, kısa fragmentten uzuna giderken son nükleotitlerin okunması aynı zamanda sekansın da okunmasını sağlayacaktır. Üstteki yöntem otonomdur ve nükleotitlere farklı renkler atayarak ayırt edilmesini sağlar, alttaki yöntem ise otoradyografi sonucudur ve okunurken aşağıdan yukarıya okuma yapılmalıdır. (Bu şekilde jel yan döndürüldüğü için soldan sağa okunur.)
ScienceDirect

Sanger yöntemi sekanslama konusunda yeni bir çağ başlatmış, biyoteknolojinin önem ve hız kazanmasını sağlamıştır. Bunların yanında Sanger metodu tam genom sekansı gibi konularda oldukça yetersiz kalmıştır. Bu yetersizlik, yeni yöntemlerin bulunmasını teşvik etmiş ve günümüzde çok efektif metodlar geliştirilmiştir. Yeni nesil sekanslama yöntemlerine genel olarak NGS (Next-generation sequencing) adı verilir.

Yeni Nesil Sekanslama Yöntemleri Nelerdir?

Illumina Sekanslama

Tarihçesi

Illumina sekanslama yöntemi, sentez yoluyla sekanslama yollarından bir tanesidir ve tek bir çalışmanın değil, bir sürecin ürünüdür. Bu çalışmaların temeli ilk olarak 1990’lı yılların ortasında, Cambridge Üniversitesi’nden Shankar Balasubramanian ve David Klenerman tarafından atılmıştır. Bu bilim insanlarının özellikle 1997’de ortaya attığı fikirler, daha sonrasında sentez yoluyla sekanslama fikirlerinin temelini oluşturmuştur. Bu bilim insanlarının fikri temel olarak, üretilen kısa sekans dizilerinin katı bir fazda paralel okunmasını içermekteydi.

Balasubramanian ve Klenerman, 1998’de aldıkları fon ile Solexa şirketini kurmuş ve 2000 yılındaki binalarına yerleşene kadar Cambridge’in Kimya Laboratuvarlarını kullanmışlardır. Bu şirket 2001 yılında, İsveç kökenli bir biyoteknoloji şirketi olan Manteia'dan aldıkları moleküler kümeleme (İng: "clustering") teknolojisi sayesinde yalnızca tek bir DNA molekülünü, maliyetini düşürerek ve sentezin doğruluk yüzdesini artırarak çoğaltma olanağına sahip oldular. Bundan bir yıl sonra ekip, ilk kez Sanger'in kendi yöntemini kullanarak dizilediği phi X-174 bakteriyofajının tüm genomunu SBS (sentez yoluyla sekanslama) ile sıraladı. SBS teknolojisi, önemli ölçüde daha fazla veri üretti ve tek bir prosedürde 3 milyondan fazla baz verisi verdi. 2006 yılında ise Solexa kendine ait ilk sekans makinesini üretmiştir. Bu teknoloji 2007 yılında Illumina şirketi tarafından alındı ve geliştirilerek Yeni Nesil Sekanslama çalışmalarına öncülük etti.

Neden Kullanılır?

Illumina sekanslama yöntemi, tek bir döngüde milyon bazlara varan veri sağladığı ve hata oranı Sanger gibi eski yöntemlere kıyasla oldukça düşük olduğu için genellikle organizmaların tüm genomlarının sekanslanmasında ve GWAS (İng: "Genome Wide Association Study", Tr: "Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları") araştırmalarında kullanılır. GWAS araştırmaları, hastalıklarla ilişkili SNP’lerin yani tek nükleotitlik değişimlerin ortaya çıkarılmasını hedefler. Bunun yanında Ekson sekanslama çalışmalarında da kullanılmaktadır.

Reklamı Kapat

Nasıl Çalışır?

Illumina boyama temelli sekanslama yöntemi en temel düzeyde üç adımdan oluşur: çoğaltma, dizileme ve analiz. Süreç DNA’nın saflaştırılması ile başlar. Saflaştırılan DNA parçalanır (yani fragmentlere ayrılır) ve referans noktası görevi gören segmentleri içeren adaptörler bu fragmentlere eklenir. Bu ekleme nano kuyu adı verilen ortamlarda gerçekleştirilir. Fragmentlerin adaptörlere bağlandığından emin olunduğunda “köprü yapılı çoğaltma" (İng: "bridge amplification") işlemi başlar.

Köprü yapılı çoğaltma, temelde DNA fragmentlerinin katı bir faza tutturulmasıyla gerçekleşen bir PCR işlemidir. Daha sonra, primerler ve modifiye edilmiş nükleotitler bu katı faza eklenir. Bu nükleotitler, tersinir bir 3'floresan blokerine sahiptir, bu nedenle DNA polimeraz, DNA fragmentlerine bir seferde yalnızca bir nükleotit ekleyebilir. Her sentez aşamasından sonra, bir kamera katı fazın fotoğrafını çeker. Bir bilgisayar, floresan etiketin dalga boyu tarafından hangi bazın eklendiğini belirler ve katı faz üzerindeki her nokta için bunu kaydeder. Her sentez aşamasından sonra, birleşmemiş fragmentler ortamdan uzaklaştırılır. Daha sonra 3 ’floresan terminal blok grubunu çıkarmak için bir “kimyasal blok çözme” adımı gerçekleştirilir. İşlem, tüm DNA molekülü dizilenene kadar devam eder.

Bu prosedürdeki işlem basamakları detaylı incelenecek olursa:

  • Genomik kütüphane nasıl hazırlanır? DNA saflaştırıldıktan sonra bir genomik kütüphane oluşturulur. Bu genomik kütüphaneyi oluşturmanın iki farklı yolu vardır: sonifikasyon ve etiketleme. Etiketleme yönteminde transposazlar kullanılır. Transposaz enzimi DNA’yı 100 ila 500 baz çiftlik fragmentlere parçalar ve rastgele bir şekilde adaptörler ekler. Genomik kütüphane oluşturmanın diğer yolu olan sonifikasyon ise ultrasonik dalgalar ile DNA’nın parçalanması işlemidir. Dikkat edilmesi gereken nokta şudur: genomik kütüphane oluştururken gDNA, yani Genomik DNA kullanılır. Genomik DNA, ekzon, intron ve Alu dizileri gibi tekrar dizilerini, yani DNA elemanlarının tamamını içerir.
Genomik DNA kütüphanesi hazırlama, gDNA'yı fragmentlere ayırmayı ve bu fragmentlere adaptörlerin eklenmesi sürecini içerir.
Genomik DNA kütüphanesi hazırlama, gDNA'yı fragmentlere ayırmayı ve bu fragmentlere adaptörlerin eklenmesi sürecini içerir.
Illumina
  • Peki bu adaptörler nedir ve ne işe yararlar? Adaptörler, DNA veya RNA’ların ucuna eklenen ve spesifik diziler içeren oligonükleotit dizileridir. Adaptörlerin bir görevi, oluşturulan DNA fragmentlerini çoğaltma işleminin gerçekleşeceği katı faza bağlamaktır. Bu katı faz akrilamid kaplı cam bir ortamdır. Adaptörlerin diğer görevi ise içerisinde bulunan altı nükleotitlik bir etiket ile fragmentlerin kimliğini oluşturmak, yani bir nevi seri numarası vermektir. Fragmentler adaptörlere bağlandıktan sonra, deneyde hata olmaması için katı faz yıkanır; böylece adaptöre bağlanmamış fragmentler uzaklaştırılır.
Tüm fragmentlere adaptörler takıldıktan sonra katı bir faza entegre edilirler. Bu adaptörler fragmentlerin bu yüzeyde tutulmasını sağlar. Tüm fragmentler bu yüzey üzerinde PCR ile çoğaltılır.
Tüm fragmentlere adaptörler takıldıktan sonra katı bir faza entegre edilirler. Bu adaptörler fragmentlerin bu yüzeyde tutulmasını sağlar. Tüm fragmentler bu yüzey üzerinde PCR ile çoğaltılır.
Illumina
  • Köprü PCR (Bridge Amplification) yöntemi ne zaman uygulanır? Katı faza bağlanma gerçekleştikten sonra başlar. Bu yöntemin amacı, birbirinin aynısı yüzlerce DNA fragmenti üretmektir. Bu işlem sonrasında çoğaltılmış olan fragmentler ileri veya geri yönlü zincirlere ait olabilir, bu nedenle adaptörler sol ve sağ olmak üzere iki çeşit kullanılır. Bu PCR yöntemiyle fragment “kümeleri” oluşturulur. Bağlı olan fragmentler klasik bir PCR işlemi ile eşlenir ve çift zincirli bir yapı oluşur. Çoğaltılan örnekler de başlangıçta “köprü” şeklindedir ve katı ortama bağlı haldedir. Eşleme işlemi sona erdikten sonra zincirler denatüre edilip tek zincirli hale getirilir ve ayrı ayrı hallerde ileri ve geri zincirler elde edilir. Tüm bu sürece “köprü” çoğaltma işlemi denir.
Köprü PCR basamağında, halihazırda bağlı bulunan fragmentler yine faza bağlı halde sentezlenir ve yeni sentezlenen zincirlerin kaybedilmesi, faza bağlı oldukları için önlenmiş olur.
Köprü PCR basamağında, halihazırda bağlı bulunan fragmentler yine faza bağlı halde sentezlenir ve yeni sentezlenen zincirlerin kaybedilmesi, faza bağlı oldukları için önlenmiş olur.
Illumina
  • Küme çoğaltma basamağı nedir? Köprü PCR sırasında oluşturulmuş ileri ve geri zincir fragmentlerinin sayısının çoğaltılması işlemidir. Farklı ileri ve geri fragmentlerin oluşturduğu gruplara küme (İng: cluster) adı verilir ve bu basamakta her kümedeki fragment çift zincirli hale gelecek şekilde eşlenip çoğaltılır. Bu basamağın amacı bir nevi kalite kontrolüdür. İleri ve geri zincirler birbirinin tamamlayıcısı olmalı, tüm ileri ve geri okuma çerçeveleri birbiriyle eşleşmelidir. Bir okuma dizisi, aynı kümedeki diğer okuma dizilerine yeterince benzemiyorsa, bir hata meydana gelmiş olabilir. Bazı laboratuvarların analizlerinde minimum %97 benzerlik eşiği kullanılmaktadır.
Fragment kümelerinin çoğaltılması, birçok okuma çerçevesi elde edilmesini sağlar ki bu da sekanslama sonrasında okuma yapıldığında, karşılaştırma yapılarak yapılan hata sayısının minimuma inmesini sağlar.
Fragment kümelerinin çoğaltılması, birçok okuma çerçevesi elde edilmesini sağlar ki bu da sekanslama sonrasında okuma yapıldığında, karşılaştırma yapılarak yapılan hata sayısının minimuma inmesini sağlar.
Illumina
  • Klonal amplifikasyonun sonunda, bütün geri zincirlerin fragmentleri yıkamayla uzaklaştırılır ve geriye yalnızca ileri zincir fragmentleri kalır. Geri yönlü zincirlerin uzaklaştırılması, katı ortama tutunmayı sağlayan yapıların yalnızca sol veya sağ adaptöre eklenmesi ile mümkün olur. Ortama eklenen primer, ileri zincirin adaptör bölgesindeki primer bağlama bölgesine bağlanır. Daha sonrasında DNA polimeraz zincire floresan olarak etiketlenmiş bir dNTP ekler. 3 ucundaki floroforun (bir floresan kimyasal bileşik) varlığı sebebiyle sentez bloke olur ve polimeraz her döngüde yalnızca bir nükleotit ekleyebilir. Ortamdaki her nükleotit çeşidine farklı bir renk atanmıştır, yani eklenen farklı türdeki nükleotitler farklı türde emisyon yaparlar; bu sayede bilgisayar emisyon farklılıklarından nükleotitleri ayırt edebilir. Bilgisayara her sinyal geldikten sonra, yani nükleotit çeşidi belirlendikten sonra, florofor uzaklaştırılır ve yeni sentezlenen ipliğe bir tane nükleotit daha eklenmesi sağlanır. Bu süreç yeni zincirin sentezi sonlanana kadar tekrarlanır.
Her sekans döngüsünde, 3' ucunda bulunan florofor nedeniyle yalnızca bir baz okunabilmektedir. Aynı anda yüzlerce farklı fragmentte aynı işlemin yapılması, bu metodu hızlı kılan etmenlerden birisidir. Her döngüde yalnızca bir baz okunuyor olması, "n" tane döngüde "n" tane baz okunabilir anlamına gelmektedir.
Her sekans döngüsünde, 3' ucunda bulunan florofor nedeniyle yalnızca bir baz okunabilmektedir. Aynı anda yüzlerce farklı fragmentte aynı işlemin yapılması, bu metodu hızlı kılan etmenlerden birisidir. Her döngüde yalnızca bir baz okunuyor olması, "n" tane döngüde "n" tane baz okunabilir anlamına gelmektedir.
Illumina
  • Veri analizi nasıl yapılır? Veri analizi, contig adı verilen, özdeş bölgelere sahip dizilerin örtüşen bölgelerinin üst üste getirilip sekansların okunması işlemidir. Binlerce contig dizisi bu şekilde örtüştürülerek ve sıralanarak sekans doğruluk oranı yüksek bir DNA dizisi elde edilir. Bu yöntem sayesinde, eğer bir referans fragment varsa, SNP’ler ve varyantlar da tespit edilebilir; bu sayede GWAS çalışmaları yürütülebilir.
Fragmentler küme amplifikasyon ile çoğaltıldığı için birçok okuma dizisi elde edilir. Contig adı verilen ortak dizilerin hizalanmasıyla kesintisiz bir okuma çerçevesi meydana getirilir ve okuma yapılır.
Fragmentler küme amplifikasyon ile çoğaltıldığı için birçok okuma dizisi elde edilir. Contig adı verilen ortak dizilerin hizalanmasıyla kesintisiz bir okuma çerçevesi meydana getirilir ve okuma yapılır.
Illumina

Illumina Sekanslamanın Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Illumina’nın köken aldığı Sanger metoduna göre en temel avantajı, aynı anda birçok fragment kullanıldığı için görece daha hızlı olmasıdır. Sanger metodunda her döngüde yalnızca tek fragment çeşidi kullanıldığı için sekanslama işlemi uzun sürmektedir ancak Illumina’da işlem daha hızlıdır. Bunun yanında Illumina fragment kümeleri kullandığı için sekanslamanın ne kadar doğru gerçekleştiğini kontrol etmek de mümkündür. Ayrıca Illumina sekanslama yöntemi örnek başına 1 ila 5 milyon veri okuması verebilir ki bu Sanger ile ulaşılması mümkün olmayan bir sayıdır.

Reklamı Kapat

Avantajlarının yanında Illumina sekanslamanın en büyük dezavantajı pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymasıdır. Çoğu yeni nesil sekanslama yöntemi gibi modifiye enzimlere ihtiyaç duymasa da Illumina sekanslamanın yapıldığı ekipmanlar ve yazılımlar oldukça pahalıdır.

İyon Yarı İletken Sekanslama

Tarihçesi

İyon-yarı iletkenli sekanslama yöntemi, yeni nesil, senteze bağlı sekanslama yöntemlerinden bir diğeridir. 2007 yılında Jonathan Rothberg tarafından kurulan Ion-Torrent şirketi tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir. Kullanmış olduğu yarı iletken çip kullanma fikri daha sonrasında Roche 454 adlı şirket tarafından geliştirilen sekanslama makinelerinde de kullanılmıştır.

Neden Kullanılır?

Büyük boyutlu genomlar sekanslanırken meydana gelebilen hatalar nedeniyle genellikle genomu büyük organizmaların DNA’sının sekanslanmasında değil mikrobiyal genom dizileme, mikrobiyal transkriptom dizileme, hedefli gen dizileme, amplikon dizileme veya genom kitaplıklarının doğruluğunun test edilmesi gibi küçük ölçekli uygulamalarda kullanılır.

Nasıl Çalışır?

Dizilenecek kalıp DNA ipliğini içeren mikro kuyu, tek bir deoksiribonükleotit trifosfat (dNTP) türü ile doldurulur. Dahil edilen dNTP, kalıpta önce gelen nükleotide komplementer ise, uzayan zincire dahil edilir. Bu işlem, bir ISFET iyon sensörünü tetikleyen ve bir reaksiyonun meydana geldiğini gösteren bir hidrojen iyonunun salınmasına neden olur. Kalıp dizide homopolimer tekrarları mevcutsa, çok sayıda dNTP molekülü tek bir döngüye dahil olacaktır. Bu, karşılık gelen sayıda serbest bırakılan hidrojen sayısındaki artışa ve orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyale yol açar. Bu teknoloji, ddNTP gibi değiştirilmiş nükleotid veya optik uygulamaların (farklı dalgaboyundaki ışıklar gibi) kullanılmaması açısından diğer sentez yoluyla sekanslama teknolojilerinden farklıdır. İyon yarı iletken dizileme; pH aracılı dizileme, silikon dizileme veya yarı iletken dizileme olarak da adlandırılır.

Bu sekanslama yöntemi şu basamakları içerir:

  • Sekanslama aşamasında modifiye enzimler veya değiştirilmiş nükleotitler kullanılmadığı için yöntem nispeten daha basit ve otonomdur. Yöntemin temelinde, dNTP’ler kalıp DNA’ya komplementer olarak eklenirken kurulan kovalent bağ oluşumu yatmaktadır. dNTP’ler kovalent bağ kurarken açığa pirofosfat ve dedektörler tarafından tespit edilecek olan H+ iyonu çıkar. Bir nükleotit, yeni sentezlenen zincire, yalnızca kalıp zincirdeki nükleotide komplementer ise katılacaktır. İyon yarı iletken sekanslamada her bir reaksiyon kuyucuğuna sadece tek tip dNTP yüklendiği için, dedektör tarafından tespit edilen bir H+ salınımı varsa, zaten kuyuda tek tip nükleotit olduğu için eklenen nükleotidin hangisi olduğu belirlenir. Sekanslanacak dizinin tek sarmal kalıbının binlerce kopyası, içerlerinde DNA polimeraz ve her birinde farklı bir dNTP olan kuyulara yüklenir. Eğer sırada eklenmesi gereken nükleotit, kuyuya yüklenmiş olan ise DNA polimeraz reaksiyonu gerçekleştirir ve ortaya bir H+ iyonu çıkar. Açığa çıkan bu hidrojen iyonu kuyucuktaki çözeltinin pH’ını değiştirir ve ISFET dedektörü bu pH değişikliğini algılar. Eğer herhangi bir sinyal algılanmadıysa bu, mevcut bulunan nükleotidin kalıpta sırada gelen nükleotide komplementer olmadığı anlamına gelir. Bu nedenle kuyuya yüklenmiş olan çözelti yıkanıp yeni nükleotit türü eklenir. Gelişmiş makinelerde bu sistem otomatiktir ve nükleotitlerin hızlıca değiştirilmesi için akış kanalı kullanır.
Deoksiribonükleotit trifosfatların sentezlenen kalıba eklenmesi, ortaya bir pirofosfat ve hidrojen iyonu çıkmasına sebep olur. Açığa çıkan bu hidrojen iyonu da detektörler tarafından tespit edilerek nükleotit eklendiği tespit edilmiş olur.
Deoksiribonükleotit trifosfatların sentezlenen kalıba eklenmesi, ortaya bir pirofosfat ve hidrojen iyonu çıkmasına sebep olur. Açığa çıkan bu hidrojen iyonu da detektörler tarafından tespit edilerek nükleotit eklendiği tespit edilmiş olur.
Wikipedia
  • Bu yöntemde tespit yöntemi olarak H+ konsantrasyonu algılayan transistörler kullanılır. Basitçe anlatmak gerekirse H+ konsantrasyonu, transistörün dedektöründen geçerken pozitif bir voltaj farklılığı yaratır. Bu yöntemde kullanılan ISFET (iyon sensitif tabla) dedektörü, pHFET (pH sensitif dedektör) gibi işlev görür, yani içerisinde bulunduğu pH değişimlerini voltaj farklılığı olarak algılayıp sinyal verir. Bu ISFET iyon dedektörü, bütün kuyuların altında bulunur. Bütün kuyular Bütünleyici Metal Oksit Yarı iletkeni (CMOS) ile kaplıdır. Reaksiyon sonucunda açığa çıkan hidrojen iyonu ISFET dedektörü tarafından algılanır ve CMOS devresine elektrik sinyali gönderilir. Kuyuda reaksiyonun gerçekleşip gerçekleşmemesine göre bilgisayar bu sinyali değerlendirir.
Açığa çıkan hidrojen iyonları, bir iyon sensörü tarafından tespit edilir.
Açığa çıkan hidrojen iyonları, bir iyon sensörü tarafından tespit edilir.
Wikipedia

İyon Yarı İletken Sekanslamanın Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Oldukça hızlı bir yöntem olması ve maliyetinin diğer sekanslama yöntemlerine göre düşük olması bu metodu öne çıkaran özellikleridir. Sentez döngüsü başına kullanılan solüsyon, enzim ve diğer malzemelerin maliyeti yaklaşık olarak 1000 dolar civarındadır; cihazın elektronik aksamı ve yazılımları ise 50 bin dolar kadardır. Bu yöntemde saatte yaklaşık olarak 100-200 civarı nükleotit sekanslanabilir. Sekanslama işleminin hızı, kullanılan COMS çiplerinin hızı ve kapasitesi ile de alakalıdır.

Agora Bilim Pazarı
Anatomi Atlası - Cilt 3: Baş, Boyun ve Nöroanatomi (Prometheus)

Boyut: 23,0*32,0
Sayfa Sayısı: 580
Basım: 2
ISBN No: 9786053553380

Devamını Göster
₺312.00 ₺354.00
Anatomi Atlası - Cilt 3: Baş, Boyun ve Nöroanatomi (Prometheus)

Bu yöntemi öne çıkaran bir diğer detay ise, bu metotta modifiye edilmiş enzim ve nükleotitlerin kullanılmasına gerek olmayışıdır. Illumina, Sanger gibi yöntemlerde kullanılan ddNTP’nin bu yöntemde kullanılmasına gerek yoktur, normal dNTP yeterlidir.

Bu avantajlarının yanı sıra birtakım kısıtlayıcı eksikler de mevcuttur. Birincisi, eğer kalıp DNA’da homopolimer dizileri varsa (TTTTTTT gibi), bu açığa birden çok hidrojeni art arda çıkaracağı için (unutmayınız: her kuyuda her döngü için tek bir dNTP türü kullanılır) elektrik sinyali oldukça büyük olacaktır, bu durumda kaç tane aynı nükleotitten bulunduğunu tespit etmek mümkün olmayacaktır. Elde edilen tek veri, kuyuda mevcut bulunan nükleotit türünün DNA’da bir homopolimer dizi şeklinde bulunduğu olacaktır.

Sekanslama yapılırken her döngüde yalnızca tek bir nükleotit kullanılır. Ortama nükleotit eklendikten sonra eğer detektörler sinyal verirse, bu zincire eklenmesi gereken nükleotitin ortama eklenmiş olan olduğunu gösterir; sinyal olmazsa ortamdaki nükleotit sıradaki komplementer nükleotit değildir ve ortam yıkanarak yeni nükleotit türü eklenir.Eğer bir homopolimer dizisi mevcutsa, art arda birçok hidrojen iyonu çıkacağı için detektör büyük bir elektrik sinyali verir. Bu elektrik sinyalinden kaç tane aynı nükleotitin yan yana olduğu belirlenemez.
Sekanslama yapılırken her döngüde yalnızca tek bir nükleotit kullanılır. Ortama nükleotit eklendikten sonra eğer detektörler sinyal verirse, bu zincire eklenmesi gereken nükleotitin ortama eklenmiş olan olduğunu gösterir; sinyal olmazsa ortamdaki nükleotit sıradaki komplementer nükleotit değildir ve ortam yıkanarak yeni nükleotit türü eklenir.Eğer bir homopolimer dizisi mevcutsa, art arda birçok hidrojen iyonu çıkacağı için detektör büyük bir elektrik sinyali verir. Bu elektrik sinyalinden kaç tane aynı nükleotitin yan yana olduğu belirlenemez.
Wikipedia

Pyrosequencing (Pirodizileme) Yöntemi

Tarihçesi

Pyrosequencing sentez bağlı sekanslama yöntemlerinden bir diğeridir. Pyrosequencing metodu ilk olarak 1993 yılında, Bertil Pettersson, Mathias Uhlen ve Pål Nyren tarafından tasarlanmıştır. Bu bilim insanlarının katı faz sekanslama tekniği; 3’ 5’ Ekzonükleaz aktivitesi içermeyen DNA Polimeraz içeren, Streptavidin kaplı manyetik boncukları ve Lusiferaz tarafından algılanan lüminisans saptanmasını içermekteydi.

1998’de Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen ve Pål Nyren tarafından sisteme Apiraz enzimi eklenmiştir. Bu enzim DNA’ya dahil edilmeyen dNTP’leri ortamdan uzaklaştırarak deneyin verimliliğini korumayı sağlar. Apiraz’ın eklendiği yöntem daha sonrasında 4 enzimli metot olarak adlandırılmıştır.

Neden Kullanılır?

Bu sekanslama yöntemi mevcut bulunan yöntemlerin büyük bir çoğunluğundan daha hızlıdır. Klasik sekanslama ve dizileme işlevlerinin yanı sıra Pyrosequencing’in özellikle kullanıldığı başka alanlar da vardır.

Hata oranının düşük olması ve hızlı olması nedeniyle bu metot özellikle tek nükleotitlik değişimlerin (SNP) tespitinde kullanılır. Yine aynı avantajları nedeniyle toprak, su gibi örneklerde bulunan farklı mikrobiyal canlıların türünün tespitinde ve genomlarının sekanslanmasında sıklıkla kullanılır.

Nasıl Çalışır?

  • Pyrosequencing, DNA sentezi sırasında salınan pirofosfatın (PPi) saptanmasına dayanan bir DNA sıralama tekniğidir. Bir dizi enzimatik reaksiyonda, dahil edilen nükleotitlerin sayısı ile orantılı olan görünür ışık üretilir. Kaskad, inorganik PPi'nin polimeraz tarafından nükleotit birleşmesinin bir sonucu olarak salındığı bir nükleik asit polimerizasyon reaksiyonu ile başlar. Açığa çıkan PPi, daha sonra, lusiferini oksitlemek ve ışık üretmek için lusiferaza enerji sağlayan ATP’ye, ATP sülfürilaz tarafından dönüştürülür. Reaksiyon ortamına eklenen nükleotit bilindiğinden, şablonun sekansı tek tek nükleotit ekleyerek belirlenebilir, yani ışık görüldüğünde ortama eklenmiş olan nükleotit bilindiği için sekanslanan nükleotit de bilinmiş olur. Standart pyrosequencing, nispeten yavaş bir polimeraz olan Escherichia coli DNA Polimeraz I'in Klenow fragmentini kullanır.
  • Pyrosequencing’de kullanılan ATP sülfürilaz, Saccharomyces cerevisiae mayasından elde edilen rekombinant bir versiyondur ve lusiferaz, Amerikan ateş böceği Photinus pyralis'ten elde edilir. Polimerizasyondan ışık tespitine kadar genel reaksiyon, oda sıcaklığında 3–4 saniye içinde gerçekleşir. Bir pyrosequencing reaksiyonunda bir pmol DNA, 6*1011 ATP molekülü verir ve bu da 560 nanometre dalga boyunda 6*109 fotondan daha fazlasını üretir. Bu ışık miktarı, bir fotodiyot, fotoçoğaltıcı tüp veya bir kamera tarafından kolayca tespit edilebilir. Halihazırda kullanılabilen iki farklı pyrosequencing metodu vardır: katı fazlı pyrosequencing ve sıvı fazlı pyrosequencing. Katı fazlı dizileme, daha önce açıklanan üç enzimli sisteme eklenmiş DNA'yı kullanır. Bu sistemde, her nükleotit ilavesinden sonra fazlalık substratı uzaklaştırmak için bir yıkama işlemi gerçekleştirilir. Sıvı fazda, patatesten elde edilen ve nükleotit parçalayan bir enzim olan apiraz kullanılır. Bu enzimin eklenmesi, katı faz ihtiyacını ve ara yıkama basamağının ihtiyacını ortadan kaldırarak pyrosequencing reaksiyonunun tek bir tüpte gerçekleştirilmesini sağlar. Bu enzim aynı zamanda yüksek katalitik aktivite gösterir ve pyrosequencing reaksiyon sistemindeki bu enzimin düşük miktarları, birleştirilmemiş nükleosit trifosfatları önce nükleosit difosfatlara ve ardından nükleosit monofosfata etkili bir şekilde indirger. Apiraz, diğer nükleotit parçalayıcı enzimlere kıyasla ürünleri tarafından daha az inhibe edilir. Bu enzim primer tasarlama aşamasında da esneklik sağlar.
Pyrosequencing, yukarıda verilen tepkimelerle gerçekleşir.
Pyrosequencing, yukarıda verilen tepkimelerle gerçekleşir.
SpringerLinks
  • "Sentez yoluyla dizileme", dizilenecek DNA'nın tek bir zincirinin alınmasını ve ardından tamamlayıcı zincirin enzimatik olarak sentezlenmesini içerir. Pyrosequencing yöntemi, başka bir kemilüminesan enzim ile DNA polimerazın aktivitesinin saptanmasına dayanır. Esasen yöntem, tek seferde bir baz çifti ekleyerek tamamlayıcı zinciri sentezleyerek ve her adımda hangi bazın eklendiğini tespit ederek tek bir DNA ipliğinin dizilenmesine izin verir. Kalıp DNA hareketsizdir ve A, C, G ve T nükleotitlerinin çözeltileri ortama sırayla eklenir ve sonrasında reaksiyondan uzaklaştırılır. Işık yalnızca nükleotidin, kalıbın ilk eşleşmemiş nükleotidine eklenmesiyle ortaya çıkar. Kemilüminesan sinyaller üreten çözelti dizisi, kalıbın dizisinin belirlenmesini sağlar.
  • Pyrosequencing'in çözelti bazlı versiyonu için, tek zincirli DNA (ssDNA) kalıbı bir dizileme primerine hibridize edilir ve bu kalıp; DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz, apiraz enzimleri ve adenozin 5´ fosfosülfat (APS), lüsiferin substarları ile inkübe edilir.

Pyrosequencing basamakları kısaca şunları içerir:

Reklamı Kapat

  1. Dört deoksinükleotit trifosfattan (dNTP'ler) birinin eklenmesi süreci başlatır. DNA polimeraz sıradaki uygun komplementer dNTP'leri kalıba dahil eder. Bu sentez reaksiyonu pirofosfatı (PPi) serbest bırakır. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken, deneyde dATP değil dαSATP kullanılmaktadır çünkü dATP, Lusiferaz enziminin doğal substratıdır; varlığında arkaplanda olmaması gereken ışımalara sebep olacaktır ve bu da verilerin bozulması anlamına gelir.
  2. ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında PPi'yi ATP'ye dönüştürür. Bu ATP, lusiferaz aracılı lusiferinin, konsantrasyonuyla orantılı miktarlarda görünür ışık üreten oksilusiferine dönüşümü için bir substrat görevi görür. Lusiferaz katalizli reaksiyonda üretilen ışık, bir kamera tarafından algılanır ve bir programda analiz edilir.
  3. Birleşmemiş nükleotitler ve ATP, apiraz tarafından degrede edilir ve reaksiyon başka bir nükleotit ile yeniden başlatılır.
Nükleotitler öncelikle yeni sentezlenen kalıba polimeraz reaksiyonu ile katılır, bu reaksiyon sonucu açığa pirofosfat çıkar. Bu pirofosfat, ATP Sülfirilaz ile ATP'ye dönüştürülür. Bu ATP de Lusiferaz'ın tepkimesinde kullanılır, bu tepkime sonucunda açığa ışık çıkar. Sonrasında kalan ATP ve diğer deoksinükleotitler apiraz tarafından degrede edilerek sentezden bağımsız ışık ortaya çıkması engellenir. (Eğer Apiraz kullanılmasaydı reaksiyon ortamının her ışık sinyalinden sonra yıkanması gerekirdi.)
Nükleotitler öncelikle yeni sentezlenen kalıba polimeraz reaksiyonu ile katılır, bu reaksiyon sonucu açığa pirofosfat çıkar. Bu pirofosfat, ATP Sülfirilaz ile ATP'ye dönüştürülür. Bu ATP de Lusiferaz'ın tepkimesinde kullanılır, bu tepkime sonucunda açığa ışık çıkar. Sonrasında kalan ATP ve diğer deoksinükleotitler apiraz tarafından degrede edilerek sentezden bağımsız ışık ortaya çıkması engellenir. (Eğer Apiraz kullanılmasaydı reaksiyon ortamının her ışık sinyalinden sonra yıkanması gerekirdi.)
Clinical Chemistry

Pyrosequencing Yönteminin Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Bu yöntemin en büyük eksiği, hata okuma ve bulma sistemlerinin olmamasıdır. Örneğin Illumina yönteminde fragmentler küme halinde dizilendiği için ortak bir sekans belirlenebiliyor ve hata yüzdesi minimize edilebiliyordu. Pyrosequencing’de herhangi bir hata okuma sisteminin olmaması, sekansın güvenilirliğini düşürmektedir. Bunun yanında Pyrosequencing’in gerçekleştiği makineler oldukça pahalıdır, bu nedenle bu yöntemin erişilebilirliği sınırlıdır.

Pyrosequencing yönteminin en bariz avantajları ise diğer yöntemlere göre oldukça hızlı olması ve tek döngüde oldukça uzun okuma dizileri verebilmesidir.

Okundu Olarak İşaretle
Bu İçerik Size Ne Hissettirdi?
  • Bilim Budur! 3
  • Muhteşem! 1
  • Tebrikler! 1
  • Mmm... Çok sapyoseksüel! 1
  • Güldürdü 0
  • İnanılmaz 0
  • Umut Verici! 0
  • Merak Uyandırıcı! 0
  • Üzücü! 0
  • Grrr... *@$# 0
  • İğrenç! 0
  • Korkutucu! 0
Kaynaklar ve İleri Okuma
  • A. M. Maxam, et al. (1977). A New Method For Sequencing Dna. Proceedings of the National Academy of Sciences, sf: 560-564. doi: 10.1073/pnas.74.2.560. | Arşiv Bağlantısı
  • Illumina. Illumina Sequencing Technology. (11 Ekim 2010). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • M. A. Quail, et al. (2008). A Large Genome Center's Improvements To The Illumina Sequencing System. Nature Methods, sf: 1005-1010. doi: 10.1038/nmeth.1270. | Arşiv Bağlantısı
  • Illumina. Explore Illumina Sequencing Technology. (01 Ocak 2015). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • J. M. Heather, et al. (2016). The Sequence Of Sequencers: The History Of Sequencing Dna. Genomics, sf: 1-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2015.11.003. | Arşiv Bağlantısı
  • Illumina. History Of Sequencing By Synthesis. (01 Ocak 2015). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • M. A. Quail, et al. (2012). A Tale Of Three Next Generation Sequencing Platforms: Comparison Of Ion Torrent, Pacific Biosciences And Illumina Miseq Sequencers. BMC Genomics, sf: 341. doi: 10.1186/1471-2164-13-341. | Arşiv Bağlantısı
  • W. Parson, et al. (2013). Evaluation Of Next Generation Mtgenome Sequencing Using The Ion Torrent Personal Genome Machine (Pgm). Forensic Science International: Genetics, sf: 543-549. doi: 10.1016/j.fsigen.2013.06.003. | Arşiv Bağlantısı
  • B. E. Deagle, et al. (2013). Quantifying Sequence Proportions In A Dna‐Based Diet Study Using Ion Torrent Amplicon Sequencing: Which Counts Count?. Molecular Ecology Resources, sf: 620-633. doi: 10.1111/1755-0998.12103. | Arşiv Bağlantısı
  • Thermo Fisher Scientific. Semiconductor Sequencing Technology - Tr. Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020. Alındığı Yer: www.thermofisher.com | Arşiv Bağlantısı
  • B. Merriman, et al. (2012). Progress In Ion Torrent Semiconductor Chip Based Sequencing. ELECTROPHORESIS, sf: 3397-3417. doi: 10.1002/elps.201200424. | Arşiv Bağlantısı
  • E. Elahi, et al. (2004). Pyrosequencing. Humana Press, sf: 211-219. doi: 10.1385/1-59259-752-1:211. | Arşiv Bağlantısı
  • P. Nyrén. (2007). The History Of Pyrosequencing®. Humana Press, sf: 1-13. doi: 10.1385/1-59745-377-3:1. | Arşiv Bağlantısı
  • M. Ronaghi. (2001). Pyrosequencing Sheds Light On Dna Sequencing. Genome Research, sf: 3-11. doi: 10.1101/gr.150601. | Arşiv Bağlantısı
  • J. F. Petrosino, et al. (2009). Metagenomic Pyrosequencing And Microbial Identification. Clinical Chemistry, sf: 856-866. doi: 10.1373/clinchem.2008.107565. | Arşiv Bağlantısı

Evrim Ağacı'na her ay sadece 1 kahve ısmarlayarak destek olmak ister misiniz?

Şu iki siteden birini kullanarak şimdi destek olabilirsiniz:

kreosus.com/evrimagaci | patreon.com/evrimagaci

Çıktı Bilgisi: Bu sayfa, Evrim Ağacı yazdırma aracı kullanılarak 10/05/2021 01:00:46 tarihinde oluşturulmuştur. Evrim Ağacı'ndaki içeriklerin tamamı, birden fazla editör tarafından, durmaksızın elden geçirilmekte, güncellenmekte ve geliştirilmektedir. Dolayısıyla bu çıktının alındığı tarihten sonra yapılan güncellemeleri görmek ve bu içeriğin en güncel halini okumak için lütfen şu adrese gidiniz: https://evrimagaci.org/s/9770

İçerik Kullanım İzinleri: Evrim Ağacı'ndaki yazılı içerikler orijinallerine hiçbir şekilde dokunulmadığı müddetçe izin alınmaksızın paylaşılabilir, kopyalanabilir, yapıştırılabilir, çoğaltılabilir, basılabilir, dağıtılabilir, yayılabilir, alıntılanabilir. Ancak bu içeriklerin hiçbiri izin alınmaksızın değiştirilemez ve değiştirilmiş halleri Evrim Ağacı'na aitmiş gibi sunulamaz. Benzer şekilde, içeriklerin hiçbiri, söz konusu içeriğin açıkça belirtilmiş yazarlarından ve Evrim Ağacı'ndan başkasına aitmiş gibi sunulamaz. Bu sayfa izin alınmaksızın düzenlenemez, Evrim Ağacı logosu, yazar/editör bilgileri ve içeriğin diğer kısımları izin alınmaksızın değiştirilemez veya kaldırılamaz.

Reklamı Kapat
Güncel
Karma
Agora
Tarım
Genetik
Santigrat Derece
Uzay
Gaz
İnsan Sağlığı
Hastalık
Hastalıkların Tedavisi
Elektrik
Doğal
Genel Görelilik
Çin
Cinsellik Araştırmaları
Elektron
Boyut
Astrobiyoloji
İnsan Türü
Genom
Avcı
Korku
Foton
Bilim İnsanları
Neandertaller
Tedavi
Periyodik Cetvel
Daha Fazla İçerik Göster
Daha Fazla İçerik Göster
Yazı Geçmişi
Okuma Geçmişi
Notlarım
İlerleme Durumunu Güncelle
Okudum
Sonra Oku
Not Ekle
Kaldığım Yeri İşaretle
Göz Attım

Evrim Ağacı tarafından otomatik olarak takip edilen işlemleri istediğin zaman durdurabilirsin.
[Site ayalarına git...]

Filtrele
Listele
Bu yazıdaki hareketlerin
Devamını Göster
Filtrele
Listele
Tüm Okuma Geçmişin
Devamını Göster
0/10000

Göster

Şifremi unuttum Üyelik Aktivasyonu

Göster

Şifrenizi mi unuttunuz? Lütfen e-posta adresinizi giriniz. E-posta adresinize şifrenizi sıfırlamak için bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Eğer aktivasyon kodunu almadıysanız lütfen e-posta adresinizi giriniz. Üyeliğinizi aktive etmek için e-posta adresinize bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Close
Geri Bildirim Gönder
Reklamsız Deneyim

Evrim Ağacı'nın çalışmalarına Kreosus, Patreon veya YouTube üzerinden maddi destekte bulunarak hem Türkiye'de bilim anlatıcılığının gelişmesine katkı sağlayabilirsiniz, hem de site ve uygulamamızı reklamsız olarak deneyimleyebilirsiniz. Reklamsız deneyim, Evrim Ağacı'nda çeşitli kısımlarda gösterilen Google reklamlarını ve destek çağrılarını görmediğiniz, daha temiz bir site deneyimi sunmaktadır.

Kreosus

Kreosus'ta her 10₺'lik destek, 1 aylık reklamsız deneyime karşılık geliyor. Bu sayede, tek seferlik destekçilerimiz de, aylık destekçilerimiz de toplam destekleriyle doğru orantılı bir süre boyunca reklamsız deneyim elde edebiliyorlar.

Kreosus destekçilerimizin reklamsız deneyimi, destek olmaya başladıkları anda devreye girmektedir ve ek bir işleme gerek yoktur.

Patreon

Patreon destekçilerimiz, destek miktarından bağımsız olarak, Evrim Ağacı'na destek oldukları süre boyunca reklamsız deneyime erişmeyi sürdürebiliyorlar.

Patreon destekçilerimizin Patreon ile ilişkili e-posta hesapları, Evrim Ağacı'ndaki üyelik e-postaları ile birebir aynı olmalıdır. Patreon destekçilerimizin reklamsız deneyiminin devreye girmesi 24 saat alabilmektedir.

YouTube

YouTube destekçilerimizin hepsi otomatik olarak reklamsız deneyime şimdilik erişemiyorlar ve şu anda, YouTube üzerinden her destek seviyesine reklamsız deneyim ayrıcalığını sunamamaktayız. YouTube Destek Sistemi üzerinde sunulan farklı seviyelerin açıklamalarını okuyarak, hangi ayrıcalıklara erişebileceğinizi öğrenebilirsiniz.

Eğer seçtiğiniz seviye reklamsız deneyim ayrıcalığı sunuyorsa, destek olduktan sonra YouTube tarafından gösterilecek olan bağlantıdaki formu doldurarak reklamsız deneyime erişebilirsiniz. YouTube destekçilerimizin reklamsız deneyiminin devreye girmesi, formu doldurduktan sonra 24-72 saat alabilmektedir.

Diğer Platformlar

Bu 3 platform haricinde destek olan destekçilerimize ne yazık ki reklamsız deneyim ayrıcalığını sunamamaktayız. Destekleriniz sayesinde sistemlerimizi geliştirmeyi sürdürüyoruz ve umuyoruz bu ayrıcalıkları zamanla genişletebileceğiz.

Giriş yapmayı unutmayın!

Reklamsız deneyim için, maddi desteğiniz ile ilişkilendirilmiş olan Evrim Ağacı hesabınıza üye girişi yapmanız gerekmektedir. Giriş yapmadığınız takdirde reklamları görmeye devam edeceksinizdir.

Destek Ol
Sizi Takip Ediyor

Devamını Oku
Evrim Ağacı Uygulamasını
İndir
Chromium Tabanlı Mobil Tarayıcılar (Chrome, Edge, Brave vb.)
İlk birkaç girişinizde zaten tarayıcınız size uygulamamızı indirmeyi önerecek. Önerideki tuşa tıklayarak uygulamamızı kurabilirsiniz. Bu öneriyi, yukarıdaki videoda görebilirsiniz. Eğer bu öneri artık gözükmüyorsa, Ayarlar/Seçenekler (⋮) ikonuna tıklayıp, Uygulamayı Yükle seçeneğini kullanabilirsiniz.
Chromium Tabanlı Masaüstü Tarayıcılar (Chrome, Edge, Brave vb.)
Yeni uygulamamızı kurmak için tarayıcı çubuğundaki kurulum tuşuna tıklayın. "Yükle" (Install) tuşuna basarak kurulumu tamamlayın. Dilerseniz, Evrim Ağacı İleri Web Uygulaması'nı görev çubuğunuza sabitleyin. Uygulama logosuna sağ tıklayıp, "Görev Çubuğuna Sabitle" seçeneğine tıklayabilirsiniz. Eğer bu seçenek gözükmüyorsa, tarayıcının Ayarlar/Seçenekler (⋮) ikonuna tıklayıp, Uygulamayı Yükle seçeneğini kullanabilirsiniz.
Safari Mobil Uygulama
Sırasıyla Paylaş -> Ana Ekrana Ekle -> Ekle tuşlarına basarak yeni mobil uygulamamızı kurabilirsiniz. Bu basamakları görmek için yukarıdaki videoyu izleyebilirsiniz.

Daha fazla bilgi almak için tıklayın