Bu Reklamı Kapat

Gen Klonlama Nasıl Yapılır?

Gen Klonlama Nasıl Yapılır?
Dna
Pixabay
Bu Reklamı Kapat
Çağrı Mert Bakırcı Editör Çağrı Mert Bakırcı
6 dakika
1,332 Okunma Sayısı
Notlarım
Bu Reklamı Kapat

Gen klonlama, konak hücre içerisinde istenilen bir genin çok sayıda kopyasını elde etme işlemidir. Eğer elinizde az bulunan önemli bir protein geni varsa ve bu proteinden daha fazlasını üretmek istiyorsanız, az sayıdaki protein geni ile bu işlemi yapmanız çok zor ve uzun sürecektir. Oysa 1970 yılında keşfedilen gen klonlama teknikleri sayesinde bir DNA parçasını istediğiniz sayıda üretebilirsiniz. Bu yazımızda gen klonlama nasıl yapılır, bunu 3 kısa basamakta açıklamaya çalışacağız.

Adım 1: Klonlanacak Genin Elde Edilmesi

Bilindiği üzere moleküler çalışmalarda doğrudan genomik veya organel DNA'sı ile çalışma yapmak tercih edilmez. Çünkü bu DNA'lar çok büyüktür, istenmeyen bölgeleri vardır ve işlevi olmayan kısımlar içerir. Bu yüzden ilgili gen parçalarını elde etmek için farklı yollar izlenir. Bunlar arasından en kolay ve en fazla tercih edilen yöntem, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (İng: "Polymerase Chain Reaction" veya kısaca "PCR") olarak bilinen bir yöntemdir. PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA'daki

PCR'ın Temel Aşamaları

DNA Zincirinin Açılması (Denatürasyon)

Kalıp DNA'nın "thermal cycler" kullanarak 95 derecede 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçiklerinin birbirlerinden ayrılmasıdır. DNA zincirini ayırmak için bazı durumlarda 5-10 dakikada ön ısıtma yapmak gerekebilir.

Bu Reklamı Kapat

Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing)

Thermal cycler içindeki sıcaklığın 37-65 dereceye kadar düşürülmesiyle işlem başlar. Sıcaklığın düşmesiyle oligonükleotit primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak saniyeler içinde gerçekleşmektedir.

Primer Uzaması

DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi vasıtasıyla uzatılmasıdır. Taq DNA polimeraz 72 derece sıcaklıkta daha iyi çalıştığından, genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılır.

PCR temel aşamaları
PCR temel aşamaları
Poimeraz Zincir Reaksiyonu

Adım 2: Genin ve Taşıyıcının Kesilmesi ve Birleştirilmesi

Kopyalanacak olan DNA parçaları, konak hücresine doğrudan giremezler. Ancak restriksiyon enzimiyle kesilmiş bir DNA parçası, "vektör" adı verilen ve yine restriksiyon enzimi ile kesilmiş başka bir DNA molekülü ile birleşirse, konak hücreye girer. Restriksiyon enzimi, DNA'daki belli nükleotit dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen enzimlerdir ve birçok çeşidi bulunmaktadır.

Bu Reklamı Kapat

Vektörler, kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden taşıyıcı DNA moleküllerindendir. Her DNA molekülü vektör olarak kullanılmaz. Aşağıdaki gibi bazı özellikleri olması gerekir:

Evrim Ağacı'ndan Mesaj

  • Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız replike edebilmelidir.
  • Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.
  • Vektörde seçicilik sağlayan marker genler bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.
  • Vektör, dolayısıyla vektörün taşıdığı DNA parçası, konaktan kolay bir şekilde ayrıştırılabilmelidir.

Bu özelliklere sahip birçok farklı klonlama vektörü vardır.

İşte bu noktada, gen ile vektörü bir araya getirmemiz gerekmektedir. DNA ligaz enzimi kullanılarak yapılan bu birleşim işlemine, ligasyon yani bağlanma denmektedir. Bağlanma için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir. Bunun için de birkaç yöntem bulunmaktadır.

Yapışkan Uçların Bağlanması

Aynı cins restriksiyon enzimle kesilmiş DNA parçaları ve vektör bir araya getirildiğinde, kökenleri farklı olsa bile birbirlerini tamamlayıcı özellikteki yapışkan uçları taşımalarından dolayı uçlar arasındaki baz eşleşmeleriyle moleküller bağlanır. Sonrasında ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları kurarak açık uçları kapatır. Bu yöntem, rDNA elde etmek için kullanılan en basit ve etkili yoldur.

Bağlayıcı ya da Aracı Moleküller Kullanarak Bağlanma

Bu yöntem, küt olan uçların bağlanmasında kullanılır. Aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır. Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşan oligonükleotidlerdir. Bu moleküller, 5' uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlu parçalara bağlanır ve bir restriksiyon enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur. Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligazla kapatılmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır.

Homopolimerik Tek Zincirli Kuyruklar Kullanarak Bağlanma

Bu yöntemle de küt uçların bağlanması sağlanmaktadır. Küt uçların 3' uçlarında terminal transferaz enzimi yardımıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar takılır. Bu yöntem, genellikle ökaryotik genlerin çoğaltılmasında kullanılır.

Bu Reklamı Kapat

Bu üç yöntemlerden birini kullanarak, genimizi vektörümüzle birleştirebiliriz. Böylece rekombinant bir vektör elde ederiz. Ancak DNA parçası vektörle çok iyi birleşse bile, henüz tam olarak hazır sayılmaz. Vektör özellikleri arasında saydığımız "marker gen" denen işaretleyici bir gene ihtiyaç vardır. Bu gen, genellikle antibiyotik direnç genidir ve ilerde bahsedeceğimiz vektörleri ayırma işleminde önemi daha net anlaşılacaktır.

Adım 3: Taşıyıcının Konak Hücreye Aktarılması

Tüm bakteri türleri, DNA alımında eşit şekilde etkili değildir ve klonlamada en çok E. coli bakterisi kullanılmaktadır.

Transformasyondan önce vektörün bakteriye daha rahat girmesini sağlamak için bakteriye bazı muameleler uygulanır. Bu uygulamalardan sonra bakteriye "kompetan bakteri hücresi" denir ve vektörü içine alma kapasitesi arttırılır.

Transformasyon Etkinliği

Konak hücrenin hedef geni taşıyan ve onu ifade edebilecek hücre dışı aracı molekülü alabilme kapasitesidir ve tamamen kompetent hücreye bağlıdır. Transformasyon öncesi konağa gönderilecek aracı molekülün konsantrasyonu iyi ayarlanmalı ve optimum miktarda olmalıdır. Az veya yoğun olması transformasyon başarısını olumsuz olarak etkiler.

Bu Reklamı Kapat

Transformasyon Etkinliğini Etkileyen Faktörler

Transformasyon basamağının başarılı olabilmesini sağlayan bir dizi faktör bulunmaktadır. Bunlar, şu şekilde sıralanabilir:

  1. Plazmid boyutu: Hücre kapasitesini zorlamayacak büyüklükte molekül olmalıdır.
  2. DNA formu: Süper sarmal yapıya sahip plazmidlerin transformasyonda daha etkili olduğu doğrulanmıştır.
  3. Hasarlı Materyal: Hücrelerin doğru şekilde kompetent hale getirilmemesi. Kullanılan materyallerin kontamine olması.
  4. Transformasyon Yöntemi: Bu alt başlığı daha ayrıntılı incelememiz gerekiyor çünkü iki farklı transformasyon yöntemimiz vardır ve oldukça önemlidir.

Transformasyon Yöntemleri

Isı Şoku

Bakterileri ve plazmidi soğuk ortamdan hızlıca sıcak ortama geçirerek, bakteri hücresinde porların açılmasını ve vektörün hücre içine girmesini sağlarız. Basamakları şu şekildedir:

  1. E. coli'ler büyümenin lag fazı evresindeyken soğuk kalsiyum klorür solüsyonuna alınır. Aynı zamanda plazmidler soğuk solüsyona atılır.
  2. Solüsyon, 42 derece de ısı şokuna alınır ve bu sırada E. coli'ler plazmidleri içine almış olur.
  3. Solüsyondan çıkarılan E. coli'ler besi ortamına alınır.

Elektroporasyon

E. coli'lere, elektroşok tüpünde elektrik vererek ve bu elektrik sayesinde hücre zarında nanometre boyutunda gözenekler açarak, E. coli'nin plazmidi içeri almasını sağlayan yöntemdir. Bu yöntemde dikkat edilmesi gereken şey, elektrik yükü altında kalmış bakterilerin besince zengin besi yerlerine hızlıca alınması gerektiğidir. Basamakları şu şekildedir:

  1. Yine lag fazındaki E. coli kültürü santrifüj edilir.
  2. Bakterileri steril suda süspanse ettikten sonra, süspanse edilen kap buzlu kova içine alınır ve bekletilir. Bu bekletmeden sonra bir kez daha santrifüj yapılır.
  3. E. coli'ler ve plazmidler elektroşok tüpüne alınır ve yüksek voltajda elektrik kısa süreli olarak verilir.

Son Adımlar

Bu iki yöntemden birini kullanarak plazmidi (vektör) E. coli bakterilerine aktardıktan sonra, bakterileri hemen uygun besi yerine almak gerekir. Uygun besi yeri, mikroorganizmaların veya hücrelerin gelişimini desteklemek için hazırlanmış sıvı yada jel olan besleyici ortamdır. Bu ortamda E. coli'ler rahatça büyür ve gelişir.

Sonrasında, vektörü alan bakterilerin hangileri olduğunu anlamak için besi yerine antibiyotik eklenir. Hatırlayacağınız üzere vektörün içinde antibiyotik direnç geni bulunmaktaydı. İşte o gen, bu basamak nedeniyle önemlidir. Bu sayede, antibiyotikli besi yerinde sadece vektörü taşıyan bakteriler kalır.

Bu vektörü taşıyan canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırmak için LacZ geni kullanılır. Vektöre başta eklenen LacZ geni, beta galaktosidaz enzimini parçalar ve ortama renk verir. Böylece vektörü taşıyan canlı hücreleri ölü hücrelerden kolaylıkla ayrılır. Ayrılan hücreleri yeni bir besi yerine alarak, çoğaltmak istenen genler istendiği kadar klonlanabilir. Klonlanan genler de protein ifadesinde kullanılarak ürüne dönüştürülebilir.

Okundu Olarak İşaretle
Bu İçerik Size Ne Hissettirdi?
  • Bilim Budur! 6
  • Muhteşem! 3
  • Merak Uyandırıcı! 2
  • Tebrikler! 1
  • Mmm... Çok sapyoseksüel! 1
  • İnanılmaz 1
  • Umut Verici! 1
  • İğrenç! 1
  • Korkutucu! 1
  • Güldürdü 0
  • Üzücü! 0
  • Grrr... *@$# 0
Kaynaklar ve İleri Okuma
  • T. A. Brown. (1990). Gene Cloning: An Introduction.. ISBN: 9781119072560. Yayınevi: Chapman and Hall.
  • Y. Zhang, et al. (2000). Dna Cloning By Homologous Recombination In Escherichia Coli. Nature Biotechnology, sf: 1314-1317. | Arşiv Bağlantısı
  • A. J. Griffiths, et al. (2015). An Introduction To Genetic Analysis. ISBN: 9781464109485. Yayınevi: W. H. Freeman.
  • Wikipedia. Transformasyon. (10 Mart 2021). Alındığı Tarih: 28 Kasım 2021. Alındığı Yer: Wikipedia | Arşiv Bağlantısı
  • C. Baum, et al. (1994). An Optimized Electroporation Protocol Applicable To A Wide Range Of Cell Lines.. Biotechniques, sf: 1058-1068. | Arşiv Bağlantısı
  • Y. Ünver. (Bilimsel Broşür, 2021). Gen Mühendisliği.

Evrim Ağacı'na her ay sadece 1 kahve ısmarlayarak destek olmak ister misiniz?

Şu iki siteden birini kullanarak şimdi destek olabilirsiniz:

kreosus.com/evrimagaci | patreon.com/evrimagaci

Çıktı Bilgisi: Bu sayfa, Evrim Ağacı yazdırma aracı kullanılarak 21/01/2022 18:24:51 tarihinde oluşturulmuştur. Evrim Ağacı'ndaki içeriklerin tamamı, birden fazla editör tarafından, durmaksızın elden geçirilmekte, güncellenmekte ve geliştirilmektedir. Dolayısıyla bu çıktının alındığı tarihten sonra yapılan güncellemeleri görmek ve bu içeriğin en güncel halini okumak için lütfen şu adrese gidiniz: https://evrimagaci.org/s/11192

İçerik Kullanım İzinleri: Evrim Ağacı'ndaki yazılı içerikler orijinallerine hiçbir şekilde dokunulmadığı müddetçe izin alınmaksızın paylaşılabilir, kopyalanabilir, yapıştırılabilir, çoğaltılabilir, basılabilir, dağıtılabilir, yayılabilir, alıntılanabilir. Ancak bu içeriklerin hiçbiri izin alınmaksızın değiştirilemez ve değiştirilmiş halleri Evrim Ağacı'na aitmiş gibi sunulamaz. Benzer şekilde, içeriklerin hiçbiri, söz konusu içeriğin açıkça belirtilmiş yazarlarından ve Evrim Ağacı'ndan başkasına aitmiş gibi sunulamaz. Bu sayfa izin alınmaksızın düzenlenemez, Evrim Ağacı logosu, yazar/editör bilgileri ve içeriğin diğer kısımları izin alınmaksızın değiştirilemez veya kaldırılamaz.

Bu Reklamı Kapat
Bu Reklamı Kapat
Size Özel (Beta)
İçerikler
Parazit
Köpekler
Antik
Tutarlılık
Elektron
Çevre
Hastalık Kontrolü
2019-Ncov
İmmünoloji
Charles Darwin
İhtiyoloji
Sivrisinek
Ay Görevleri
Kimyasal
Gözlem
Yıldız
Retrovirüs
Mucize
Yılan
Koronavirüs
Yaşamın Başlangıcı
Sahtebilim
Özel Görelilik
İlaç
Jeoloji
Daha Fazla İçerik Göster
Evrim Ağacı'na Destek Ol
Evrim Ağacı'nın %100 okur destekli bir bilim platformu olduğunu biliyor muydunuz? Evrim Ağacı'nın maddi destekçileri arasına katılarak Türkiye'de bilimin yayılmasına güç katmak için hemen buraya tıklayın.
Popüler Yazılar
30 gün
90 gün
1 yıl
EA Akademi
Evrim Ağacı Akademi (ya da kısaca EA Akademi), 2010 yılından beri ürettiğimiz makalelerden oluşan ve kendi kendinizi bilimin çeşitli dallarında eğitebileceğiniz bir çevirim içi eğitim girişimi! Evrim Ağacı Akademi'yi buraya tıklayarak görebilirsiniz. Daha fazla bilgi için buraya tıklayın.
Etkinlik & İlan
Bilim ile ilgili bir etkinlik mi düzenliyorsunuz? Yoksa bilim insanlarını veya bilimseverleri ilgilendiren bir iş, staj, çalıştay, makale çağrısı vb. bir duyurunuz mu var? Etkinlik & İlan Platformumuzda paylaşın, milyonlarca bilimsevere ulaşsın.
Podcast
Evrim Ağacı'nın birçok içeriğinin profesyonel ses sanatçıları tarafından seslendirildiğini biliyor muydunuz? Bunların hepsini Podcast Platformumuzda dinleyebilirsiniz. Ayrıca Spotify, iTunes, Google Podcast ve YouTube bağlantılarını da bir arada bulabilirsiniz.
Yazı Geçmişi
Okuma Geçmişi
Notlarım
İlerleme Durumunu Güncelle
Okudum
Sonra Oku
Not Ekle
Kaldığım Yeri İşaretle
Göz Attım

Evrim Ağacı tarafından otomatik olarak takip edilen işlemleri istediğin zaman durdurabilirsin.
[Site ayalarına git...]

Filtrele
Listele
Bu yazıdaki hareketlerin
Devamını Göster
Filtrele
Listele
Tüm Okuma Geçmişin
Devamını Göster
0/10000

Göster

Şifremi unuttum Üyelik Aktivasyonu

Göster

Şifrenizi mi unuttunuz? Lütfen e-posta adresinizi giriniz. E-posta adresinize şifrenizi sıfırlamak için bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Eğer aktivasyon kodunu almadıysanız lütfen e-posta adresinizi giriniz. Üyeliğinizi aktive etmek için e-posta adresinize bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Close
Geri Bildirim Gönder
Reklamsız Deneyim

Evrim Ağacı'nda reklamları 2 şekilde kapatabilirsiniz:

  1. Ücretsiz üye girişi yapmak: Sitedeki reklamların %50 kadarını kapatmak için ücretsiz bir Evrim Ağacı üyeliği açmanız ve sitemizi/uygulamamızı kullanmanız yeterli!

  2. Maddi destekçilerimiz arasına katılmak: Evrim Ağacı'nın çalışmalarına Kreosus, Patreon veya YouTube üzerinden maddi destekte bulunarak hem Türkiye'de bilim anlatıcılığının gelişmesine katkı sağlayabilirsiniz, hem de site ve uygulamamızı reklamsız olarak deneyimleyebilirsiniz. Reklamsız deneyim, sitemizin/uygulamamızın çeşitli kısımlarda gösterilen Google reklamlarını ve destek çağrılarını görmediğiniz, %100 reklamsız ve çok daha temiz bir site deneyimi sunmaktadır.

Kreosus

Kreosus'ta her 10₺'lik destek, 1 aylık reklamsız deneyime karşılık geliyor. Bu sayede, tek seferlik destekçilerimiz de, aylık destekçilerimiz de toplam destekleriyle doğru orantılı bir süre boyunca reklamsız deneyim elde edebiliyorlar.

Kreosus destekçilerimizin reklamsız deneyimi, destek olmaya başladıkları anda devreye girmektedir ve ek bir işleme gerek yoktur.

Patreon

Patreon destekçilerimiz, destek miktarından bağımsız olarak, Evrim Ağacı'na destek oldukları süre boyunca reklamsız deneyime erişmeyi sürdürebiliyorlar.

Patreon destekçilerimizin Patreon ile ilişkili e-posta hesapları, Evrim Ağacı'ndaki üyelik e-postaları ile birebir aynı olmalıdır. Patreon destekçilerimizin reklamsız deneyiminin devreye girmesi 24 saat alabilmektedir.

YouTube

YouTube destekçilerimizin hepsi otomatik olarak reklamsız deneyime şimdilik erişemiyorlar ve şu anda, YouTube üzerinden her destek seviyesine reklamsız deneyim ayrıcalığını sunamamaktayız. YouTube Destek Sistemi üzerinde sunulan farklı seviyelerin açıklamalarını okuyarak, hangi ayrıcalıklara erişebileceğinizi öğrenebilirsiniz.

Eğer seçtiğiniz seviye reklamsız deneyim ayrıcalığı sunuyorsa, destek olduktan sonra YouTube tarafından gösterilecek olan bağlantıdaki formu doldurarak reklamsız deneyime erişebilirsiniz. YouTube destekçilerimizin reklamsız deneyiminin devreye girmesi, formu doldurduktan sonra 24-72 saat alabilmektedir.

Diğer Platformlar

Bu 3 platform haricinde destek olan destekçilerimize ne yazık ki reklamsız deneyim ayrıcalığını sunamamaktayız. Destekleriniz sayesinde sistemlerimizi geliştirmeyi sürdürüyoruz ve umuyoruz bu ayrıcalıkları zamanla genişletebileceğiz.

Giriş yapmayı unutmayın!

Reklamsız deneyim için, maddi desteğiniz ile ilişkilendirilmiş olan Evrim Ağacı hesabınıza yapmanız gerekmektedir. Giriş yapmadığınız takdirde reklamları görmeye devam edeceksinizdir.

Destek Ol
Sizi Takip Ediyor

Devamını Oku
Evrim Ağacı Uygulamasını
İndir
Chromium Tabanlı Mobil Tarayıcılar (Chrome, Edge, Brave vb.)
İlk birkaç girişinizde zaten tarayıcınız size uygulamamızı indirmeyi önerecek. Önerideki tuşa tıklayarak uygulamamızı kurabilirsiniz. Bu öneriyi, yukarıdaki videoda görebilirsiniz. Eğer bu öneri artık gözükmüyorsa, Ayarlar/Seçenekler (⋮) ikonuna tıklayıp, Uygulamayı Yükle seçeneğini kullanabilirsiniz.
Chromium Tabanlı Masaüstü Tarayıcılar (Chrome, Edge, Brave vb.)
Yeni uygulamamızı kurmak için tarayıcı çubuğundaki kurulum tuşuna tıklayın. "Yükle" (Install) tuşuna basarak kurulumu tamamlayın. Dilerseniz, Evrim Ağacı İleri Web Uygulaması'nı görev çubuğunuza sabitleyin. Uygulama logosuna sağ tıklayıp, "Görev Çubuğuna Sabitle" seçeneğine tıklayabilirsiniz. Eğer bu seçenek gözükmüyorsa, tarayıcının Ayarlar/Seçenekler (⋮) ikonuna tıklayıp, Uygulamayı Yükle seçeneğini kullanabilirsiniz.
Safari Mobil Uygulama
Sırasıyla Paylaş -> Ana Ekrana Ekle -> Ekle tuşlarına basarak yeni mobil uygulamamızı kurabilirsiniz. Bu basamakları görmek için yukarıdaki videoyu izleyebilirsiniz.

Daha fazla bilgi almak için tıklayın

Önizleme
Görseli Kaydet
Sıfırla
Vazgeç
Bu Eseri Neden Tavsiye Ediyorsun?
Aşağıdaki kutuya, isimli neden tavsiye ettiğini girebilirsin. Ne kadar detaylı ve kapsamlı bir analiz yaparsan, bu eseri [OKUMAK/İZLEMEK] isteyenleri o kadar doğru ve fazla bilgilendirmiş olacaksın. Tavsiyenin faydalı bulunması halinde Evrim Ağacı kullanıcılarından daha fazla UP kazanman [UP bilgi linki] mümkün olacak. Tavsiyenin sadece negatif içerikte olamayacağını, eğer bu sistemi kullanıyorsan tavsiye ettiğin içeriğin pozitif taraflarından bahsetmek zorunda olduğunu lütfen unutma. Yapıcı eleştiri hakkında daha fazla bilgi almak için burayı okuyabilirsin.
Tavsiye Et