Evrim Ağacı

COVID-19 Tanısında En Güvenli Yöntem: Kantitatif Revers-Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT-PCR)

COVID-19 Tanısında En Güvenli Yöntem: Kantitatif Revers-Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT-PCR)
Tavsiye Makale

Bu yazı, Evrim Ağacı'na ait, özgün bir içeriktir. Konu akışı, anlatım ve detaylar, Evrim Ağacı yazarı/yazarları tarafından hazırlanmış ve/veya derlenmiştir. Bu içerik için kullanılan kaynaklar, yazının sonunda gösterilmiştir. Bu içerik, diğer tüm içeriklerimiz gibi, İçerik Kullanım İzinleri'ne tabidir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), laboratuvar ortamında bir tüpün içinde belirli bir DNA parçasının DNA polimeraz enzimi ile çoğaltılması işlemine denilmektedir. Bu işlemde DNA miktarı milyon katlarına kadar arttırılabilmektedir.

PCR, 1985’te ABD’de bulunan Cetus Şirketinde çalışan Henry A. Erlich, Randall K. Saiki ve Kary Mullis tarafından DNA klonlanmasının daha az zahmetli ve kısa sürmesi için geliştirilmiştir. K. Mullis bu buluştan dolayı 1993’te Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmıştır.

Günümüzde PCR farklı amaçlar için klinik, farmasotik alanlarının yanında antropoloji, arkeoloji ve ziraat gibi çeşitli alanlarda da kullanılmaktadır. PCR, kalıtsal hastalık teşhisinde, kanser araştırmalarında, adli tıp çalışmalarında, rekombinant protein ve aşı geliştirilmesinde, bakteri ve virüs tespiti gibi birçok amaçla kullanılabilmektedir.

PCR'ın Aşamaları

PCR’nun üç temel aşaması vardır:

  1. Denatürasyon: Denatürasyon, yüksek sıcaklık (95oC) ile DNA’nın çift sarmalları arasındaki hidrojen bağlarının kırılarak sarmaldaki zincirlerin ayrılmasına denir.
  2. Primer Bağlanması: İkinci aşamasında, primerler (iki tür 5-30 bazlık tek iplikcikli spesifik oligonükleotidler) ayrılan DNA zincirlerinin uç (3’) kısmına daha düşük sıcaklıkta (50-60oC) bağlanırlar.
  3. DNA Sentezi: Son aşamada ise primerlerin bağlandığı bölgeden yüksek sıcaklıkta çalışabilen (72oC) Thermus aquaticus’tan izole edilen Taq DNA polimeraz bağlanarak DNA sentezlenmesi gerçekleşir.

Bu üç aşamanın gerçekleşmesine bir döngü denilmektedir. Genellikle bir PCR 25-35 döngüden oluşmaktadır. Üçüncü basamaktan sonra sıcaklık tekrardan 95oC’ye çıkartılarak yeni oluşan DNA’ların da ayrılmasıyla yeni döngünün başlaması sağlanır. 

PLOS One

20-35 döngüden sonra çoğalan DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi yöntemi ile analiz edilmektedir. Aynı zamanda reaksiyondaki olası kontaminasyonu elemek için negatif kontrol olarak, tüpün içerisine test edilen örnek dışında diğer tüm reaksiyon içeriği konulmaktadır. Bu reaksiyonun bir sonuç verilmemesi beklenmektedir. Reaksiyonun düzgün çalışıp doğru sonucu verdiğini anlamak için de pozitif kontrol olarak da sonuç vereceği bilinen bir örnek kullanılmaktadır

Eğer test edilmek istenilen örnek RNA ise, PCR metodunun kullanılabilmesi için önce RNA’nın DNA’ya çevrilmesi gerekmektedir. Bu amaçla Revers-Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemi geliştirilmiştir. Retrovirüslerden izole edilen revers-transkriptaz enzimi sayesinde RNA’dan komplementer DNA (cDNA) sentezlenmektedir ve sentezden sonra yukarıda anlatıldığı gibi cDNA çoğaltılarak analiz yapılabilir. Böylelikle kan, serum, hücre kültürleri, dokular ve bakteri kültürlerindeki test edilmek istenilen RNA tespit edilerek, miktarı için de analiz edilebilmektedir. 

Gerçek Zamanlı PCR Yöntemi

Bu elektroforez aşamasından kurtulmak için, daha kısa sürede yanıt alınabilen ve çoğaltılan DNA’nın analizini sağlayan Gerçek Zamanlı PCR yöntemi geliştirilmiştir.

Bu yöntemde, DNA çoğalması ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresan sinyali ölçülmektedir. Bu floresan sinyali, floresan işaretli proplar veya çift sarmallı DNA’ya bağlandığı zaman ışıma yapabilen boyalar sayesinde her yeni oluşan DNA parçasının kantitatif analizi reaksiyon sırasında yapılabilmektedir.

Boyalar, özgül olmayan belirleme yöntemine girerken floresan işaretli proplar özgül belirme yöntemi içerisindedir. Çünkü boyaların (örneğin SYBR Green I) bağlanıp ışıma yapabilmesinin tek şartı çift sarmallı bir DNA olması, DNA’nın spesifik bir nükleotid dizilimine sahip olması gerekmemektedir.

Proplar ise çoğaltılmak istenilen DNA’nın özel bölgesine göre tasarlanarak sadece o spesifik bölgenin varlığında ışıma yapmaktadır. Bu özgül belirleme yöntemlerinin başında, “TaqMan probe”, “Molecular Beacon”, “Light-up” prob, hibridizasyon prob ve “Scorpion” gibi primerleri gelmektedir.

TaqMan Prob Yöntemi

“TaqMan probe” yönteminde tek zincirli floresan işaretli bir komplementer prob kullanılmaktadır. Bu probun bir ucunda (5’ kısmında) “fluorophore” diğer ucunda ise (3’ kısmı) “quencher” bulunmaktadır. Bu ikili sistemin amacı kendiliğinden ışımayı baskılamaktır. Hatta prob DNA zincirine bağlansa bile bu arka plandaki “gürültü” dolarak adlandırılan floresan ışıması oldukça düşüktür.

Taq polimeraz Taq Man probun bağlı olduğu bölgeye geldiğinde, polimerazın 5’→3’ nükleaz aktivitesi sayesinde prob ucundaki boya ayrılır. Böylelikle diğer boyanın baskılaması ortadan kaldırılarak floresan sinyali oluşturur. Her bir döngü de çoğaltılan DNA ile birlikle, eğer bölge çoğaltılıyorsa, bu sinyal de artarak analiz yapılmasını sağlar.

Moleküler Boncuk Yöntemi

“Molecular Beacon” (Moleküler Boncuk) yönteminde ise saç tokası şeklinde uçları bir birbirine bağlı ve orta kısmı da çoğaltılmak istenilen DNA ya özgü halkasal bir prob kullanılmaktadır. Bu moleküler boncuğun her iki ucunda da birbirine yakın oldukları için baskılayan iki tane florokrom boya bulunmaktadır. Komplementer DNA zinciriyle karşılaştığında saç tokası şeklinden düz tek zincirli hale gelir ve böylelikle boyaların arasındaki mesafe artar ve boyalar ışıma yapmaya başlamaktadır. Bu durumda da yine DNA çoğalması floresan sinyali ile analiz edilebilmektedir.

Hibridizasyon Prob Yöntemi

Hibridizasyon prob yönteminde ise iki farklı prob kullanılmaktadır ve birisinin 3’ ucu diğerinin de 5’ ucunda floresan işaretli boya bulunmaktadır. Bu boyalar normal halde ışıma yapma kabiliyetine sahip değillerdir ama DNA’nın tek zincirine bağlandıklarında aralarındaki mesafe azaldığından dolayı enerji transferi olur (dönor boyadan alıcı boyaya) ve transfer edilen enerji alıcı boyanın ışıma yapmasını sağlamaktadır. Bu sayede de yine floresan sinyali incelenmektedir.

Literatürde bu stratejiler kullanılarak oluşturulmuş ve farklı çalışmalarda kullanılan binlerce tanı ve tespit yöntemi bulunmaktadır.

Gerçek Zamanlı PCR Cihazı
Gerçek Zamanlı PCR Cihazı
USGS

COVID-19 Salgınında PCR Nasıl Kullanılıyor?

Peki SARS-COV-2 salgınıyla mücadeledeki en önemli araç olan RT-PCR tabanlı tanı işlemi nasıl yapılıyor?

Dünya genelinde salgın ve hastalıklarla mücadele merkezlerinin yayınladıkları protokoller ve Dünya Sağlık Örgütü'nün yönlendirmeleri dikkate alınarak, acil durum kullanımına açılmış olan RT-PCR tasarımlarının üretilmesi ve tanı merkezlerinde kullanılması şu anda bilinen en yaygın ve en güvenilir tespit yöntemidir.

Amerika ve Çin bünyesindeki hastalık kontrol merkezleri (Center for Disease Prevention and Control) ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) gibi köklü kurumların web sitelerinden incelenebilecek bu primer-prob çiftleri hastalık belirtilerinin görüldüğü durumlarda hastalardan alınan örnekler üzerinde kullanılabilmektedir. İlgili hastalık belirtileri ve tespit kitleri ile alakalı bilgileri kaynakça kısmında bulabilirsiniz.

Örnek Toplama Basamağı

Tanı merkezlerinde öncelikle, yine uluslararası hastalık teşhis protokolleri kullanılarak yapılan ön muayeneler sonucu koronavirüs şüphesi bulunan hastaların geniz bölgesinden steril örnek çubuğu ile alınan süprüntü örnekleri toplanmaktadır. Bu bölgenin koronavirüs lokalizasyonunda en yoğun bölgelerden biri olduğu da yine literatürdeki çalışmalarla ispatlanmıştır.

Philadelphia Inquirer

RNA İzolasyon Kitleri

Ardından alınan örneklerden yine ticari olarak satın alınabilen RNA izolasyon kitleri kullanılarak total RNA izolasyonu yapılır ve izole edilen RNA’nın DNA sekansına çevrilmesi yukarıda belirtildiği gibi “ters transkripsiyon” reaksiyonu ile gerçekleştirilir. Bu reaksiyon için de yine ticari olarak üretilen geniş bir ürün yelpazesi bulunmaktadır.

Test Aşaması

Çoğaltılan ve DNA’ya çevrilen örnekler son aşamada, uluslararası standartlarca belirlenen ve onlara uygun olarak üretilip tespit kitlerine yerleştirilen prob ve primerlerle önerilen koşullardaki RT-PCR reaksiyon karışımı içerisine konulur ve RT-PCR cihazı ile ilgili örneklerin test edilmesi gerçekleştirilir.

RT-PCR Neden Güvenilir?

Önemli bir nokta olarak tekrar belirtmekte fayda var ki bu işlemler, oluşabilecek hataların fark edilmesi ve test duyarlılığının arttırılması için mutlaka pozitif kontroller, negatif kontroller ve birden fazla tekrarla yapılmaktadır.

Dünya genelinde bir günde yapılan milyonlarca teste rağmen kullanılan prob ve primer tasarımları ile alakalı şüpheler de hala tartışma konusudur. Bu tartışmaların odak noktası, primer/prob çiftlerinin bağlanma bölgeleri dolayısıyla sebep olabildiği yanlış pozitif-yanlış negatif sonuçları, gösterdikleri gürültü sinyalinin yüksekliği ve uygulanan örnek toplama yöntemindeki eksiklikleri kapsamaktadır. Yine bu tartışmalarda öne sürülen problemlerin bir kısmı laboratuvar koşullarında test edilerek doğrulanmış ve ilgili primer-prob sistemlerinin güncellenmesine hatta değiştirilmesine sebep olabilmiştir.

Özetle, RT-PCR tekniği gerek uygulama kolaylığı gerekse düşük maliyet ve yüksek duyarlılık eşiği gibi özellikleri ile birçok farklı alanda tanı ve teşhis işlemlerinin standardı olarak değerlendirilmektedir. Her ne kadar elde edilen test sonucu sadece aktif bulaşıya dair ispat niteliğinde olsa da yeniden bulaşma, yanlış negatif-yanlış pozitif sonuç gibi durumlarda optimizasyona ihtiyaç duymaktadır.

Bu İçerik Size Ne Hissettirdi?
  • Muhteşem! 4
  • Tebrikler! 9
  • Bilim Budur! 1
  • Mmm... Çok sapyoseksüel! 1
  • Güldürdü 0
  • İnanılmaz 2
  • Umut Verici! 0
  • Merak Uyandırıcı! 3
  • Üzücü! 0
  • Grrr... *@$# 0
  • İğrenç! 0
  • Korkutucu! 0
Kaynaklar ve İleri Okuma

Evrim Ağacı'na her ay sadece 1 kahve ısmarlayarak destek olmak ister misiniz?

Şu iki siteden birini kullanarak şimdi destek olabilirsiniz:

kreosus.com/evrimagaci | patreon.com/evrimagaci

Çıktı Bilgisi: Bu sayfa, Evrim Ağacı yazdırma aracı kullanılarak 01/06/2020 01:05:14 tarihinde oluşturulmuştur. Evrim Ağacı'ndaki içeriklerin tamamı, birden fazla editör tarafından, durmaksızın elden geçirilmekte, güncellenmekte ve geliştirilmektedir. Dolayısıyla bu çıktının alındığı tarihten sonra yapılan güncellemeleri görmek ve bu içeriğin en güncel halini okumak için lütfen şu adrese gidiniz: https://evrimagaci.org/s/8512

İçerik Kullanım İzinleri: Evrim Ağacı'ndaki yazılı içerikler orijinallerine hiçbir şekilde dokunulmadığı müddetçe izin alınmaksızın paylaşılabilir, kopyalanabilir, yapıştırılabilir, çoğaltılabilir, basılabilir, dağıtılabilir, yayılabilir, alıntılanabilir. Ancak bu içeriklerin hiçbiri izin alınmaksızın değiştirilemez ve değiştirilmiş halleri Evrim Ağacı'na aitmiş gibi sunulamaz. Benzer şekilde, içeriklerin hiçbiri, söz konusu içeriğin açıkça belirtilmiş yazarlarından ve Evrim Ağacı'ndan başkasına aitmiş gibi sunulamaz. Bu sayfa izin alınmaksızın düzenlenemez, Evrim Ağacı logosu, yazar/editör bilgileri ve içeriğin diğer kısımları izin alınmaksızın değiştirilemez veya kaldırılamaz.

Evrim Ağacı %100 okur destekli bir bilim platformudur. Maddi destekte bulunarak Türkiye'de modern bilimin gelişmesine güç katmak ister misiniz?
Destek Ol
Gizle
Güncel
Ağız
Bağışıklık
Sars
Stres
Kütle
Alkol
Zaman
Su Ayısı
Balık
İnsan
Köpek
İnsanlık
Lgbt
Mit
Gezegen
Kültür
Değişim
Zehir
Beslenme
Homeostasis
Diş
Sars-Cov-2 (Covid19 Koronavirüs Salgını)
Uzay Görevleri
Fare
Süpernova
Daha Fazla İçerik Göster
Daha Fazla İçerik Göster
Türkiye'deki bilimseverlerin buluşma noktasına hoşgeldiniz!

Göster

Şifrenizi mi unuttunuz? Lütfen e-posta adresinizi giriniz. E-posta adresinize şifrenizi sıfırlamak için bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Eğer aktivasyon kodunu almadıysanız lütfen e-posta adresinizi giriniz. Üyeliğinizi aktive etmek için e-posta adresinize bir bağlantı gönderilecektir.

Geri dön

Close
“Doğa, nazik veya gaddar değildir. Zulmü sevme ya da sevmeme gibi bir tercihi de yoktur. Bir konu DNA'nın korunumunu ilgilendirmediği sürece doğa tamamen nötrdür.”
Richard Dawkins
Geri Bildirim Gönder