Eksozom Nedir? Hücre Dışı Kesecikler, Kanserin Erken Evrede Teşhisinde Nasıl Kullanılır?

Dünyada her yıl çok sayıda insana kanser teşhisi konmaktadır. Ancak kanser teşhisi genellikle 1. evreden sonra gerçekleştiğinden, tanı konulan hastaların büyük çoğunluğu hayatını kaybetmektedir. Her geçen gün yeni teşhis yöntemleri bulunsa da en geç 1. evrede teşhis sağlayabilecek bir tanı araç/kiti büyük önem taşımaktadır. Bu yazıda, eksozomlar hakkında bilgi verip, kanser teşhisinde kullanılmalarından bahsedeceğiz.

Kanser gibi günümüzde önüne geçilemeyen ve ölüm oranı giderek artan bir hastalıkta en önemli nokta erken teşhistir. Günümüzde meme kanseri, kadınlarda en çok ölüme yol açan kanserdir. Son yıllarda farklı teşhis yöntemleri kullanılmasına rağmen bu yöntemler uzun zaman alır, maliyetleri yüksektir ve hatalı sonuçlar verebilirler.

Eksozomların hücreler arası iletişimi sağlama gibi görevlerine ek olarak sağlıklı hücelerin kanserleşmesi ile ilgili fonksiyonlarının da olduğu son yıllarda keşfedilmiştir. Bununla birlikte, hücreler arasında dolaşan bu küçük keseciklerin varlığını ve miktarını saptayan ticari cihazlar mevcut değildir. Meme kanserinin patofizyolojik mekanizmaları hakkında her geçen gün artan veriler sayesinde biyomoleküler belirteçler tanı için kullanılabilecek duruma gelmiştir. Bunlardan biri olan eksozomların tanı amaçlı kullanılmaları, yeni bir yaklaşımdır.

Hücre Dışı Kesecikler

Hücre dışı keseciklerin geçtiğimiz yıllara kadar sadece hücre atığını atmaktan sorumlu olduğu düşünülse de son yıllarda bilim camiası tarafından önemli görevlerinin olduğu anlaşılmaya başlanmıştır. Hücre dışı kesecikler, immün yanıtın düzenlenmesi gibi görevleri olup hücreler arası iletişimde rol oynamaktadırlar.

Hücre içi kökenlerine göre farklılaşan üç tür hücre dışı kesecik vardır:

• Apoptotik Cisimler: 50 nm ile 5000 nm arasında değişen boyutlara sahiptir ve deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit (RNA) ve piston proteinleri gibi hücresel biyomolekülleri içerir. Apoptoz sırasında apoptotik cisimler, bu içerikleri, hücre yutulmasını gerçekleştiren makrofajlara sunar.
• Mikro Kesecikler: Ektosomlar, mikropartiküller ve plazma zarı türevli veziküller olarak da bilinir. Dışa doğru tomurcuklanma ve plazma zarlarından parçalanma yoluyla, 50 nm ile 1000 nm arasında değişen büyüklükte mikro kesecikler oluşur. Mikro kesecikler oluştuktan sonra taşıdıkları spesifik proteinleri ve lipidleri, belirlenmiş alıcı hücreye temsil ederler.
• Eksozomlar: Hücre dışı keseciklerin son kategorisi, temel olarak hücre içi kökenleri ve büyüklükleri bakımından diğer hücre dışı keseciklerden farklı olan eksozomlardır. Bu yazımızda eksozomlara odaklanacağız ve onları ayrıca ele alacağız.

Journal of Endocrinology

Eksozom Nedir?

Eksozomlar, hücreler tarafından hücre dışı ortama salınan ve boyutları 150 nm'den küçük doğal keseciklerdir. Çift katlı fosfolipid zarla çevrili olan bu kesecikler içerisinde lipidler, proteinler, çeşitli nükleik asit türleri ve türevleri olan mRNA'lar (mesajcı RNA), miRNA'lar (mikro RNA), lncRNA'lar (uzun kodlama yapmayan RNA) ve DNA parçacıkları gibi birçok biyomolekül taşır. Vücutta bulunan hemen hemen tüm hücreler tarafından salınırlar.^[1]

Eksozom salınımının ilk evresi plazma membranının içeri doğru girinti yapacak şekilde endozom oluşturmasıdır. Hücre içindeki erken endozom, geç endozoma doğru olgunlaşırken endozom membranının içe doğru girintiler yapması ve bunların kapanmasıyla çeşitli intralüminal veziküller oluşur. Bu noktada endozomlar, "multiveziküler cisimcikler" adını alırlar. Multiveziküler cisimciklerin plazma membranıyla kaynaşması sonucunda eksozomlar hücre dışını salınırlar.^[2]

Günümüzde, eksozomların hücreler arası haberleşme, genetik malzeme aktarımı, sinyal iletimi ve immün yanıtın düzenlenmesi gibi birçok biyolojik işlevde önemli rol üstlendikleri yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir.^{[3], [4]} Kan, idrar, amniyotik sıvı, anne sütü, serum, ter, plazma gibi bütün vücut sıvılarında bulunurlar.^[5] Eksozomların tüm vücut sıvılarından ayrışabilmeleri, girişimsel olmayan ve özgün tanı yöntemlerinin gelişmesine olanak sağlamaktadır.^[6]

Eksozomların Kanserle İlişkisi

Eksozomların çeşiti görevlerinin fark edilmesiyle birlikte, kanserin tanısında ve hastalık seyrinin gözlemlenmesinde biyobelirteç olarak kullanılma potansiyelleri konusunda yapılan çalışmalar ivme kazanmıştır. Çoğu durumda prime kanserler, cerrahi rezeksiyon ve adjuvan tedavi ile yok edilebilirler. Bununla birlikte metastatik kanserlerin tamamen yok edilmesi zordur ve bunlar kansere bağlı ölümlerin yaklaşık %90'ını oluştururlar. Artan kanıtlar, eksozomların ve içeriklerinin metastaz öncesi mikroortam oluşumuna katkı yaptığını göstermiştir.^[7]

Frontiers in Oncology

Tümör hücrelerinin metastazı ve istilası, hücre dışı kesecikler tarafından geliştirilebilir ve tümör hücrelerinin lokal ve uzak yayılmasını kolaylaştırır. Metastatik tümörlerin gerçek metastaik hücreler tarafından oluşturulmasından önce, bu doku bölgeleri birincil tümörlerden salınan faktörlerle metastatik ön odaklar olarak belirlenir. Son çalışmalar, tümör kaynaklı hücre dışı keseciklerin, metastaik bölgedeki normal konak hücreleriyle etkileşime girdiklerini ve bu şekilde metastatik odakların oluşmasına yol açtıklarını göstermektedir. Bu da metastaz yapılarının rastgele olmadan nasıl oluştuklarının anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.^[7] Anjiyogenez (yeni damarların oluşumu), hızlı büyüyen katı tümörlerin besin kullanılabilirliğini düzenleyen önemli bir işlevdir. Eksozomlar, tümör anjiyogenezini indükleyici özellikleri sayesinde de kanser metastazını etkilemektedir.^[8]

Boyut ve yoğunluk gibi özellikler, eksozomları tanımlamak için katı kriterler olarak kullanılamaz. Bu sebeple eksozomlardaki seçici bir protein altı kümesinin tanımlanması, bu veziküllerin saflığını tanımlamak ve değerlendirmek için değerli bir araç olacaktır. Proteomik ve lipidomik analizler, eksozomların tanımlanmış bir lipit ve protein kompozisyonuna sahipsahip olduğunu göstermektedir. ExoCarta ve EVPedia veritabanlarında toplanan en son proteomik sonuçlara göre; eksozomlar, hücre tipine spesifik tanımlı bir protein yapısına sahiptir. Bu bağlamda, eksozomlar tetraspaninlerde yüksek oranda zenginleştirilmiş olarak tarif edilmiştir ve olası eksozom belirteçleri olarak tetraspaninler önerilmiştir. Tetraspaninler CD9, CD63, CD37, CD81 veya CD82, eksozomların zarında özel olarak zenginleştirilir ve genellikle eksozom biyobelirteçleri olarak kullanılır. Çeşitli araştırmalar CD63 ve CD81'i eksozomlarda en sık bulunan proteinler olarak tanımlar ve eksozomların klasik belirteçleri olarak kabul ederler. Aslında, birçok hücrede CD63'ün miktarı, endozom/lizozomal orijinli hücre içi bölümlerinde tipik olarak tanımlanmıştır. Bu yüzden eksozom kullanmak, meme kanseri ve bazı kanser türlerinin teşhisi açısından avantajlıdır.^[6] Kansere bağlı antijenler, kanser kaynaklı eksozom yüzeyleri üzerinde oldukça zengindir.^[9] Ayrıca erken evre meme kanseri hastaları ve kontrol grubuna yönelik bir çalışmada CD63’ün meme kanseri hastalarında daha fazla miktarda bulunduğu gözlenmiştir. Bu da tanı konusunda önemini ortaya koymaktadır.^[10]

Kanser Nedir?

Kelime anlamı olarak kanser, bir organ veya dokudaki hücrelerin düzensiz olarak bölünüp çoğalmasıyla ortaya çıkan kötü urlara denir. Genel anlamda ise kanser organizmanın çeşitli bölgelerindeki hücrelerin kontrolsüz çoğalması ile oluşur. Normalde organizmanın sağlıklı ve düzgün çalışması için hücrelerin büyümesi, bölünmesi ve bu sayede daha çok hücre üretmesine ihtiyaç vardır. Bazen bu süreç doğru işlemez ve hücreler kontrolsüz bir şekilde bölünerek çoğalıp tümör oluştururlar.^[11]

Kanser hücreleri, kan veya lenf dolaşımına karışarak vücudun diğer bölgelerine gidebilirler. Gittikleri yerlerde koloniler oluştururlar ve çoğalmaya devam ederler. Kanserin bu şekilde vücudun diğer bölgelerine yayılmasına metastaz adı verilir.^[11] Metastaza uygun ortam hazırlamada eksozomların belirleyici bir rol oynadığı düşünülmektedir.^[7]

Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) 2018 yılı verilerine göre; 2018 yılında tahminen 18,1 milyon yeni vakanın ve 9,6 milyon ölümün gerçekleşmesiyle küresel kanser yükünün arttığı belirtilmiştir. Dünya çapındaki 5 erkekten birinin ve 6 kadından birinin kansere yakalandığı ve 8 erkekten biriyle 11 kadından birinin bu hastalıktan öldüğü rapor edilmiştir. Aynı raporda dünya çapında 5 yıllık kanser tekrarlanma sıklığının 43,8 milyon olarak tahmin edildiği belirtilmiştir.^[12]

Akciğer kanseri, kadın meme kanseri ve kolorektal kanser 2018 yılında en sık görülen kanserlerdir. Bu üç kanser türü dünya genelinde kanserin görülme sıklığının ve ölüm yükünün üçte birinden sorumludur. Akciğer ve kadın meme kanserleri, yeni sayıları açısından dünya liderleridir. Bu türlerin her biri 2018 yılında 2,1 milyon tanıyla, toplam kanser insidansının yaklaşık %11,6’sını oluşturmuşlardır.^[12] Kanser hakkında çok daha fazla bilgiyi buradan alabilirsiniz.

World Health Organization International Agency for Research on Cancer

Meme Kanseri Nedir?

Dünya genelinde kadınlarda tanı konan tüm yeni kanser vakalarının yaklaşık dörtte biri (%24,2) meme kanseridir ve en sık görülen kanser türüdür. Meme kanseri aynı zamanda kadınlarda kanserden ölümlerin %15’ini oluşturur ve birinci sırada bulunur.^[12] Yaşamı boyunca her sekiz kadından birinde meme kanseri görülür ve tüm dünyada giderek artan önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir.

Türkiye’deki en güncel meme kanseri istatistiği 2016 yılında Sağlık Bakanlığı tarafından yapılmıştır ve bu istatistiklere göre meme kanseri %45,90’lık oranla ülkemiz kadınları arasında en yaygın görülen kanser tipidir. Meme kanserinin görülme sıklığı, son yıllarda giderek artmıştır.^[11]

Meme Kanserinde Teşhis

Meme kanserinde erken tanı çok önemlidir. Erken tanı konan meme kanserinde hem tedavi çok kolay hem de başarı şansı çok yüksektir. Örneğin kadınlardaki 5 yıllık sağ kalım oranı verilerine göre lokalize tümörlerde (evre 0 ve 1) sağ kalım oranı ve tedavi başarısı %99, bölgesel olarak yayılmış tümörlerde %86 iken, uzak metastaz yapmış tümörlerde bu oran %27’ye düşmektedir.^[13]

Meme kanserinde sıklıkla teşhis yöntemi olarak mamografi, ultrasonografi, MR görüntüleme ve biyopsi gibi yöntemler kullanılmaktadır. Mamografi kanser dokusunu görüntülemek için kullanılabilir ya da elle ayırt edilemeyen kitleler, mamografi ile tespit edilebilir. Ultrasonografi ile de yine kitlenin yeri ve büyüklüğü tespit edilebilir. Tümörün kan akımı renkli Doppler ultrason ile incelenebilir.^[14]

Uzun yıllar boyunca mamografinin meme kanseri teşhisi için uygun bir tarama yöntemi olduğu düşünülmüştür. Ancak katı ve kistik kitleler arasında ayrım yapma yeteneğinden mahrumdur ve olguların %10-15’ini kaçırabilmektedir. O yüzden maliyeti düşük ve güvenilir yeni yaklaşımların ortaya koyulması önemlidir.^[14]

Optik Biyosensörler ve LSPR

Optik biyosensörler, iletim ve ölçüm özellikleri bakımından diğerlerine göre (elektrokimyasal, kalorimetrik vb.) bir adım öndedir. Biyolojik ve kimyasal moleküllerin etiketsiz, doğrudan ve gerçek zamanlı algılanmasını sağlamaları açısından geleneksel yöntemlerden çok daha avantajlıdır. Aynı zamanda hassas ve küçük boyuttadırlar. Optik biyosensör, biyotanıma ve algılama elemanı ile onunla bütünleşmiş bir transdüserden oluşur. Etiketsiz biyo tanımada, madde ölçülür ve analiz edilen maddenin transdüseri ile etkileşimi ve maddenin konstantrasyonuyla orantılı olan bir sinyal üretilir.^[15]

Literatürde bilinen çeşitli optik biyosensörler arasında Lokalize Yüzey Plazmon Rezonansı (LSPR) tabanlı biyosensörler, büyük metalik yapılarda olmayıp metalik nano-yapıların eşsiz optik özelliklerini taşırlar. Bir yüzey plazmonu; ışığın dalga boyuyla karşılaştırılabilir bir boyuta sahip bir partikül yani bir nanopartikül ile sınırlı olduğunda, partikülün serbest elektronları kolektif salınımına katılır ve lokalize yüzey plazmonu olarak adlandırılır. LSPR’nin optik olayı, ışık altın nanoçubuklarla etkileşime girince gerçekleşir ve ışığın elektromanyetik alanı nanoçubuklarda sınırlı kollektif elektron yük salınımlarını ve ardından ultraviyole görünür bandında ışığın emilimini sağlar. LSPR’nin diğer yaygın bir optik biyosensör çeşidi olan SPR tabanlılardan farkı ise indüklenmiş plazmonların, metal/dielektrik arayüz boyunca değil, nano yapı üzerinde lokal olarak salınmasıdır. Yüzeyde bir bağlama olayı meydana geldiğinde dielektrik çevresel değişimden kaynaklı bir dalga boyu kayması olur.^[15]

LSPR’nin özellikleri kullanılan malzemeye, metalik nanopartiküllerin boyutuna ve şekline büyük ölçüde bağlıdır. Bu parametrelerin değiştirilmesiyle LSPR dalga boyu; görünür, yakın kızılötesi ve kızılötesi bölgeye uygun şekilde ayarlanabilir. Böylece LSPR sensöründen elde edilen dalga boyunun belirli araştırmalar için arzu edildiği şekilde oluşması sağlanmış olur.^[16]

Eksozomu Algılayan LSPR Temelli Biyosensör Yöntemi ile Kanser Teşhisi

Eksozomların biyobelirteç olarak kullanılması yeni bir bakış açısıdır. Bilindiği üzere tümör hücreleri normal hücrelere oranla daha fazla eksozom salgılar. Kolay erişimi ve in vivo stabiliteyi koruması, güvenilirliği, minimum invazite ve sıvı biyopsileri tekrarlanabilir kılan fosfolipit bilayer membran stabilitesi onu uygun bir biyobelirteç yapar. Eksozomlar az miktarda insan sıvısından hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir.^[17]

Biyolojik tanıma elemanının seçimi, tamamen tanıma elemanı ve hedef arasındaki bağlanma afinitesine ve etkinliğine bağlıdır. En klasik biyolojik tanıma, antijen-antikor etkileşiminin "kilit ve anahtar" modelidir. Eksozomal proteinler etkili antijenlerdir ve biyosensörler geliştirilirken antijen-antikor uyumu iyi bir şekilde gerçekleştirilir.^[9] Kanser hücresi kaynaklı eksozomlar; mutant onko-proteinler, onkogenik transkriptler, microRNA ve DNA dizileri gibi hastalığın moleküler işaretlerini ve efektörlerini taşır. Eksozomların içeriği türetildikleri orijinal hücrelere yakından bağlı olduğu için eksozomlar giderek yeni tanısal veya prognostik biyobelirteçler olarak kabul edilir.^[17]

Kanser için yeni ve invaziv olmayan biyobelirteçleri bulmak önemli bir klinik zorunluluktur. Eksozom, biyobelirteç olarak yeni bir bakış açısıdır. Diğer erken teşhis yöntemleri, kanserin yayılmaya başlamış olması veya belirli bir dokuda etkisini göstermesiyle yapılsa da eksozom temelli teşhiste amaç, o kanserin geçmişini incelemek ve ona sebep olan kanser ajanını teşhis etmektir yani daha da geriye gidip o kanseri oluşturanın kökenine bakmaktır. Kolay erişimi ve in vivo stabiliteyi koruması, güvenilirliği, minimum invaziteye sahip olması onu uygun bir biyobelirteç yapmaktadır.^[17] Ayrıca literatürde de belirtildiği üzere tümör hücreleri normal hücrelere oranla daha fazla eksozom salgılamaktadır.^[18]

Günümüzde kullanılan kanser teşhis yöntemlerinde cevabın uzun sürede alınması hasta için zaman kaybıdır. Kanserin heterojenik yapısı, doktoru yanlış yönlendirerek hastalığa yanlış bir tanı konulmasına yol açabilir. Dolayısıyla, kanserin erken ve doğru teşhisi hastanın sağ kalımını ciddi bir oranda etkilemektedir. Bu açıdan, biyosensörün teşhiste hatayı minimalize edip 30 dakika gibi kısa bir sürede teşhis sağlamakla beraber ileride hastanede ortamında kolaylık sağlaması öngörülmektedir.

Nanoteknoloji ile biyolojinin bütünleşmesi, disiplinlerarası yeni bir dal olan nanobiyoteknolojiyi ortaya çıkarmıştır. Son yıllarda da hastalık teşhis ve tedavisinde kullanılan araçlarda nanomalzemelerden yararlanılmaktadır. Günümüzde, nanoyapılardan biri olan altın nanopartiküllerin biyosensörler bazında en uyumlu ve en işlevsel olmaları bakımından kullanımları ivme kazanmıştır. Nanomalzemelerin genel özelliklerine ek olarak altın nanopartiküllerin kendilerine has eşsiz özellikleri vardır: Biyomoleküller ile iyi uyumluluk; altın nanopartiküller, Au-S veya Au-N bağları vasıtasıyla tiyol ve amin gibi farklı fonksiyonel gruplar içeren biyomakromoleküller ile kolayca fonksiyonelleştirilir. Mükemmel optik performans gösterir. Kontrollü üretim sayesinde altın nanopartiküllerin kesin, düzgün bir boyutta ve kontrollü şekillerde kolayca hazırlanabilir. Bu özellikler, altın nanopartikülleri biyosensör uygulamaları için uygun bir seçim haline getirir.^[16] Gümüşün altınla karşılaştırıldığında reaktivitesinin yüksek olması, kolayca oksitlenebilmesi nedeniyle altın biyolojik ortamlara daha uygundur.^[19]

Sonuç ve Öneriler

Eksozom teşhisi için hassas ve güvenilir bir sistem olduğu düşünülen tanı sistemlerinin, ileriki aşamalarda sistemin kanser spesifik uygun biyomarkerlar ile modifiye edilmesiyle beraber eksozomlar yardımıyla birçok kanser türünde spesifik teşhis sağlaması mümkün görülmektedir. Farklı kanser türlerine ait eksozomların tespitine yönelik antikorların entegre edilmesiyle modifiye edilebilir ve kliniklerde kanserin erken tanısı için rutin bir kontrol yöntemi olarak kullanılabilir. Ayrıca herhangi bir kanserin alt tipini belirlemek için eksozomlarla spesifik bağlanma yapan antikorların biyosensörde kullanılmasıyla kanser alt tiplerinin sınıflandırılması da yapılabilir. Böylece pahalı, büyük ekipmanlara gerek kalmadan kanser türlerinin erken teşhisini sağlayacak kullan-at tarzı biyosensörler kullanılabilir.

Biyosensörler, sadece tampon çözeltiyle hazırlanan eksozom çözeltilerinde değil; kan, tükürük ve idrar gibi tüm vücut sıvılarından alınan örneklerin incelenmesinde de kullanılabilir. Bu vücut sıvılarından eksozom analizine yönelik hassas, güvenilir, kolay uygulanabilir ve düşük maliyetli kanser tarama yöntemleri geliştirilebilir.