Tardigradlar ve Uzay: TARDIKISS Misyonu Nedir?

Değerli okurlarımız bu yazımızda sizlere yakın zamanda sitemizde yayınlamış olduğumuz TARSE projesinin devam niteliğinde olan TARDIKISS (Uzayda Tardigrades) misyonundan bahsedilecektir. Tardigradların uzay streslerine karşı göstermiş olduğu diğer FOTON-M3 misyonları olan TARDİS ve RoTaRad hakkında ileri okuma yapmak isterseniz linklere tıklamanız yeterlidir.

TARDIKISS Misyonu Nedir?

TARDIKISS deneyi, 2011 yılında İtalyan Uzay Ajansı ve İtalyan Hava Kuvvetleri tarafından düzenlenen DAMA (Karanlık Madde) misyonu sırasında gerçekleştirilen bir dizi multidisipliner deney olan Biokon in Space (BIOKIS) projesinin bir parçasıydı. Uzay Mekiği Endeavor (son görevi STS-134) içerisinde yer alan mikro yer çekimi ortamından yararlanarak nispeten kısa sürede (16 gün) deneylerin yapılması adına Uluslararası Uzay İstasyonu'na ulaştı.

TARDIKISS üç örnek setten oluşuyordu: bir uçuş numunesi ve iki yer kontrol numunesi. Bu numuneler, mikro yer çekimi, hayatta kalma, yaşam döngüsü, DNA bütünlüğü ve antioksidan olarak çalışan moleküllerin yolakları da dahil olmak üzere uzay stresörlerini test etmek için kullanılan biyolojik materyali sağladı. Bu yazımızda, Paramacrobiotus richtersi ve Ramazzottius oberhaeuseri olmak üzere iki tardigrad türünün uçuş ve kontrol örnekleri arasındaki bazı antioksidan moleküllerin, tiyobarbitürik asit gibi reaktif maddelerin ve yağ asidi değerlerinin karşılaştırılması yapılmıştır.

NASA

Tardigradların Uzay Görevlerinde Model Organizma Olarak Kullanılmasının Sebebi Nedir?

Uzay araştırmalarına olan ilgi arttıkça, tek ve çok hücreli organizmaların mikro yer çekimi de dahil olmak üzere elverişsiz uzay koşullarına tepkisini tahmin etmek ve bilmek büyük önem kazanmaktadır. Uzay şartlarına maruz bırakma deneylerinde kullanılan canlılar sayesinde, çevresel stres faktörlerinin getirdiği risklerden kaçınmak için adaptasyonlar geliştiren canlıların bu adaptasyonları tespit etmemize ve tespit edilen adaptasyonların mekanizmalarını anlamamıza olanak sağlar.

Bugüne kadar, uzay stresörlerine karşı fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları anlamak için birçok çalışmada tek hücreli organizmalar veya çok hücreli organizmanın kültür hücreleri çalışıldı. Fakat hücre kültürü deneyleri nispeten yararlı olmasına rağmen, bizlere sadece ilk yaşam organizasyonu seviyesini temsil etmektedir. Bu yüzden çok hücreli bir canlı organizmanın tepkisi ile karşılaştırılamayacağı çarpıcı bir gerçektir. Uzay araştırmalarında hayvanların kullanımı gün geçtikçe yaygınlaşmak ile birlikte bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar insanın fizyolojik, biyokimyasal yapıları ile karşılaştırılarak geleceğe dair izleyeceğimiz yön hakkında bizlere ışık tutar.

Hayvanlar uzay araştırmalarında faydalı modeller olmalarına rağmen kullanımları çoğu zaman büyük hacimli spesifik yetiştirme biyo-reaktörlerine ihtiyaç duymasıyla sınırlıdır. Tardigradlar veya su ayıları, bu sorunun üstesinden gelmeye izin veren çok yakın tarihlere kadar az bilinen ve ihmal edilen hayvanlardı.

Uzay araştırmalarında kullanımları sahip oldukları bazı özellikler ile diğer canlı gruplarının arasından sıyrılmalarını sağlar. Bu özellikler şunlardır;

• Küçük tesislerde / biyoreaktörlerde tutulabilen ve yetiştirilebilen minyatür hayvanlardır (200 ila 1000 mikrometre uzunluğunda).
• Nispeten gelişmiş doku ve organlara sahip olmakla birlikte "eutely" adı verilen sınırlı sayıda hücre sayısına (türlere göre değişmek ile birlikte 400 ile 1000 arasında) sahip.
• Laboratuvar koşullarında kolayca yetiştirilebilirler.
• Birçoğu partenogenetik (yumurtanın döllenmeden yeni birey meydana getirmesi), genellikle apomiktiktir (olumsuz koşullarda eşeysiz üreyebilir), bu nedenle klonal soylar elde edilebilir.

Tüm tardigradlar sucul olmasına rağmen, anhidrobiyoz adı verilen askıdaki halleri sayesinde karasal ekosistemlerde de dağılım gösterebilmişlerdir. Fakat hala karasal ekosistemlerde yer alsa da aktif olabilmek için su filmine ihtiyaç duymaktadırlar. Anhidrobiyoz adı verilen fizyolojik duruma giren tardigradlar, vücutları içerisinde bulunan suyun %97'sini kaybedebilirler ve "tun" adı verilen korunma formları sayesinde orijinal boyutunun yaklaşık üçte biri kadar küçüle bilirler. Tardigradlar yeniden su ile buluşturulduklarında ise birkaç dakika ile birkaç saat arasında aktif hallerine geri dönebilirler. Kurutulmuş tardigradlar anhidrobiyoz durumları devam ettiği sürece 10 yıla aşkın yaşayabilir. Bu durum sayesinde fiziksel ve kimyasal aşırılıklara karşı da dikkate değer bir dayanıklılık sergilediği belgelenmiştir. Tam kuruma, şiddetli soğuk, mikro yer çekimi, vakum, yüksek seviyelerde iyonize ve UV radyasyonlarına dayanma yeteneklerine sahip olan anhidrobiyotik tardigradlar, uzay şartları dahil yeryüzünde karşılaşılabilecekleri en zorlu streslerin üstesinde gelebilecek donanıma veya genetik mirasa sahip oldukları düşünülmektedir.

American Scientist

"Yukarıda belirtiğimiz birçok kelimenin ve anhidrobiyotik durum gibi diğer kriptobiyotik durumları açıkladığımız tardigradlar hakkındaki yazımıza buradan ulaşabilirsiniz."

Tardigradlar, 2007'de FOTON-M3 projesi sırasında farklı misyonlar (TARDIS; TARSE; RoTaRad) ile alçak Dünya yörüngesinde uzay stresörlerine maruz kalmıştır. TARDIKISS projesi TARSE projesinin devamı niteliğinde olduğundan bahsetmiştik, bu kanıya varmamızın en temel sebebi TARDIKISS projesi öncesinde TARSE projesindeki tek tardigrad türü olan Paramacrobiotus richtersi'nin hem kurumuş hem de aktif haldeki bireylerin fizyolojik durumlarının uzay koşullarına tepkilerinin analizinin gerçekleştirilmiş olması ve çalışmada da aynı tür üzerinde yeniden çalışılmasıdır.

Daha önceki çalışmalarda Dünya'da yetiştirilen kontrol grubu tardigradlar ile uçuş görevindeki tardigradlar arasında üreme konusunda karşılaştırma yapıldığında mikro yer çekimi ve radyasyonun, daha fazla sayıda yumurta bırakılmasına (burada sayımı yapılan yumurtalar "yumurtlanmış" yani dişi bireyin vücudundan uzaklaştırılmış yumurtalardır [bu uzaklaştırma vücudu terk eden yumurtanın çevreye bırakılması ile olabileceği gibi M. tardigradum'da karşılaştığımız exuvium içerisine de bırakılabilir]), daha kısa bir yumurta gelişim süresine ve daha fazla sayıda yeni doğan bireylerin kaydedilmesine olanak sağlamıştır.

Fakat hayvanların hayatta kalması ve yaşam öyküsü özellikleri üzerinde hiçbir etkisi tespit edilememiştir. Ek olarak, uzay misyonu sırasında aktif tardigradlarda, glutatyon içeriğinde bir artış, glutatyon peroksidaz aktivitesinde bir artış ve katalaz, süperoksit dismutaz ve glutatyon redüktaz aktivitelerinde bir azalma gözlenmiştir. Son olarak, tiyobarbitürik asit reaktif maddelerinde bir değişiklik tespit edilmemiştir. Bu sonuçlara dayanarak, hayatta kalma, yaşam öyküsü özellikleri ve antioksidan savunmaların mikro yer çekimi maruziyeti de dahil olmak üzere tardigradlarda stres faktörlerinin derinlemesine etkisinin araştırılması amacıyla yeni bir uzay misyonu (TARDIKISS [Uzaydaki Tardigrades]) gerçekleştirilmiştir.

Akın Karahasan

TARDIKISS projesinin uçuş misyonunda yer alan tardigradlar çok yüksek hayatta kalma sürelerine (% 91'den fazla) sahiptiler ve dişiler, yetişkinlik düzeyine geldiklerinde çoğalabilen "normal" yeni doğan üretebilmeyi başarmışlardı. Fakat araştırmacılar bu verilerin dışında yazımızın başlarında da belirttiğimiz üzere uçuş misyonundaki tardigradlar ile Dünya'daki kontrol grupları arasındaki antioksidan aktivitesi, tiyobarbitürik asit gibi reaktif maddeler ve yağ asidi bileşimi üzerine karşılaştırmalar sunmuşlardır.

Tardigradların Uzay Şartlarına Dirençlerinin Ölçüldüğü Çalışmalar Nasıl Yapıldı?

Tardigradların seçimi ve toplanması: TARDIKISS misyonunda iki anhidrobiyotik (kurutulmuş (tun) formdaki) eutardigrade türü, Paramacrobiotus richtersi ve Ramazzottius oberhaeuseri kullanıldı. Paramacrobiotus richtersi, FOTON misyonunda zaten kullanılmış, bu yüzden araştırmacılara pek çok açıdan referans sağlaması oldukça büyük bir avantajdı. P. richtersi'nin toplama/örnekleme işlemi fındık yapraklarından gerçekleştirildi. Bu canlılar hakkında kısaca bilgi vermek gerekir ise; etçil, beyaz renkli ve çalışmalarda kullanılan popülasyonun bireyleri biseksüeldi. R. oberhaeuseri bir liken olan Xanthoria parietina'dan ekstrakte edildi; otçul, kahverengi / kırmızı renkli ve bu çalışmada dikkate alınan popülasyon unisexual ve partenogenetikdi. Tardigratları ekstrakte etmek için yaprak çöpü ve liken musluk suyu içerisinde 15 dakika bekletildi. Daha sonra her bir liken ve yaprak çöpü kısaca substratlar akan su altında bir elek yardımı ile elendi; daha sonra hayvanlar, bir stereomikroskop altında cam pipet ile elenmiş çökeltilerden toplandılar.

Her iki tardigrad türü için kurutulmuş (anhidrobiyotik) fizyolojik durumdaki hayvanlar kullanılmıştır. Kurutulmuş örnekleri elde etmek için tardigradlar, kontrollü ortamda belli bir bağıl nemde (RH) ve sıcaklık altında laboratuvarda kurutuldu. Kurutulma işleminin öncesinde ise tardigradlara herhangi bir besin kaynağı verilmeden 24 saat boyunca suyun içerisinde beklemeleri sağlandı. Daha sonra, hayvan gruplarını doğal maden suyu içeren bir kare kurutma kağıdı üzerine yerleştirerek kademeli olarak kurumaya zorlandılar. Tardigradlara sahip kağıtlar, parafilm ile kaplanmış on iki küçük plastik Petri kabında saklandı. Petri kaplarının bulunduğu alanda her misyonda olduğu gibi termometreler ve dozimetreler yer alıyordu. Tüm uçuş görevi sırasında sıcaklık profili 21^∘C ila 25^∘C arasında nispeten sabitken, uzay radyasyonuna maruz kalmaya bağlı doz eşdeğer oranları ise ölçümü yapan iki farklı cihazın verilerine göre 320 µSv ve 360 µSv değerlerine sahipti.

Sv: Enerjileri aynı farklı ışınların hücreler üzerindeki etkisi de farklıdır. Örneğin alfa ışınları hücre içerisinde aynı enerjideki beta ışınlarından çok daha fazla molekülün iyonlaşmasına neden olur ve dolayısıyla vücutta daha büyük tahribat yapar. Bu nedenle, her türlü ışın, ışın etki çarpanıyla belirlenen bir eşdeğer dozla ölçülür. Bu ölçü birimine Sievert (Sv) deniyor. µSv birimi ise Mikrosieverttir. Bu birimin gama, beta ve x-ışınları için çarpanı 1'dir.
  

Biyokimyasal Analizler: Uçuş misyonundan kurutulan numuneler Dünya'daki kontrol grupları ile karşılaştırıldı. Bu karşılaştırmadı dikkat edilen biyomoleküller ise yazımızın başında belirtiğimiz bazı serbest radikal yakalayıcılar olan Superoksit dismutaz (SOD toplam aktivitesi), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon redüktaz (GR) enzimleriydi ve aktiviteleri değerlendirildi. Aynı şekilde toplam glutatyon (GSH) içeriği, tiyobarbitürik asit gibi reaktif maddeler (TBARS) ve yağ asidi bileşimleri de tespit edilip değerlendirildi.

İstatistiksel analiz: Veriler SPSS programı kullanılarak MannWhitney testi ile analiz edildi.

SpectrumNews

Kısaca enzim tayinleri için substratlar ve reaktifler satın alındı ve ilgili işlemlere uygulanmak adına görevlerde kullanılmış tardigradların yer aldığı kopyalar hazırlandı. Akabinde hazırlanan kopyaların her biri farklı bir göreve sahip olup o görev ile ilgili prosedürlerin takip edilmesi ile biyo-moleküllere ait veriler elde edildi.

1. Enzim süperoksit dismutazın aktivitesi, NAD(P)H oksidasyon inhibisyonuna dayanan yöntem kullanılarak test edildi.
2. Katalaz aktivitesini değerlendirmek için, örneklerin hidrojen peroksit (H₂O₂) tüketimi ölçülerek test edildi.
3. Selenyuma bağımlı glutatyon peroksidazın aktivitesini değerlendirmek için, enzim aktivitesi, NADPH ve glutatyon redüktaz varlığında gerçekleştirildi.
4. Toplam glutatyonu ölçmek için, tardigratlar buz üzerinde %5 metafosforik asit içinde homojenize edildi; homojenat, 4°C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjlendi ve süpernatan (santrifüjden sonraki tortu), bazı hafif modifikasyonlarla analiz edildi.
5. Tiyobarbitürik asit reaktif maddeleri (TBARS) değerlendirmek için, tardigrad numuneleri, belli standartlara sahip kimyasal bileşenlerin varlığında, FeSO4 ve askorbik asit ile lipit peroksidasyonunun indüksiyonundan önce ve sonra test edildi.
6. Yağ asidi kompozisyonunu değerlendirmek için lipitler, kloroform-metanol ile 10 adet kurutulmuş tardigrade grubundan ekstrakte edildi.

Not: Yazımızın prosedür kısmında diğer yazılarımızda da uyguladığımız gibi çok fazla teknik bilginin yer almasını istemiyoruz. Çünkü karşılaşılan kavramlar ve işlemler bu alanda spesifik olarak çalışmalar yürüten kişiler tarafından anlaşılabilecektir, bu yüzden yukarıda yer alan paragraflarda sadece işlemin adı verilmiştir. Detaylı bilgi için lütfen kaynak kısmında yer alan makalenin materyal ve metot kısmına göz atın.
  

Tardigradlar Üzerine Yapılan Testler Bizlere Ne Gösteriyordu?

Paramacrobiotus richtersi ve Ramazzottius oberhaeuseri türleri enzim aktivitelerinin sonuçları her zaman proteinlerin mikrogram ile ilişkili olarak gösterilir. Türlerin "doğal" formları dikkate alındığında R. oberhaeuseri'nin P. richtersi'ye kıyasla daha az miktarda protein içermektedir.

Her iki türde de, enzim aktivitelerinin ve uçuş (F) ile sıcaklık kontrol numuneleri (TC) arasındaki diğer antioksidan moleküllerin karşılaştırmalı analizi çok az farklılık göstermiştir. Özellikle, R. oberhaeuseri F numunelerinde TC numunelerine göre glutatyon redüktaz aktivitesinde önemli bir azalma tespit edilmiştir. İstatistiksel olarak desteklenmese de, bu türde katalaz, süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz aktivitesini ve ayrıca glutatyon içeriğini de azaltma eğilimi saptandı. P. richtersi'de katalaz, süperoksit dismutaz ve glutatyon redüktaz aktivitelerini azaltma ve glutatyon peroksidaz aktivitesini artırma eğilimi saptandı. Sonuçların gösterdiği üzere iki tür arasındaki ROS süpürücü enzimlerin aktivitelerinde farklılıklar yer almaktadır.

F ve TC numunelerinin yağ asidi deneyleri sonucunda elde edilen verilere odaklandığımızda R.oberhaeuseri'de TC numunelerine göre F numunelerindeki yağ asidi C22-6 n-3 ve çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) için önemli bir azalma kaydedilmiştir. Dahası, R. oberhaeuseri, P. richtersi'ye kıyasla önemli ölçüde daha düşük miktarda C22-6 n-3'e sahip olduğu gözlenmiştir.

Tardigradlardaki tiobarbitürik asit gibi reaktif maddelerin (TBARS) miktarı, in vitro peroksidasyon indüksiyonundan önce ve sonra olarak kaydedilmiştir. Başlangıç aşamasında ve peroksidasyonun indüklenmesinden sonra ki aşamada her iki türdeki F ve TC numuneleri arasında hiçbir fark saptanmamıştır.

Behance

TARSE Deneyi ile Tutarlı Veriler Elde Edilmiş Miydi?

Uzay stres koşullarına maruz kalmak oksidatif stresi tetikler. Aşırı reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ile antioksidan savunmaların sınırlı etkisi arasındaki dengesizlikten kaynaklanan oksidatif stres, ateroskleroz, hipertansiyon, inflamasyon, kanser, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları gibi birçok önemli insan patolojisinin gelişiminde rol oynamaktadır. Oksidatif stresde, düşük hücresel su içeriği ROS üretimini azaltsa bile anhidrobiyotik organizmalarda da oldukça yıkıcı etkileri olabilir. Normal koşullar altında, antioksidan sistemler ROS'un neden olduğu olumsuz etkileri en aza indirir, ancak kuruma stresi (kısaca tardigradlar tun formundayken), metabolik aktivite olmadığı veya azaldığı için bu savunma kontrol mekanizmalarının kaybolmasına veya azalmasına neden olabilir.

Bazı hayvanlara nazaran tardigradların aşırı kurumadan kurtulma yeteneği, yapısal, fizyolojik ve moleküler düzeyde çalışan karmaşık bir dizi faktörü içerir. Moleküler / biyokimyasal açıdan bakıldığında, anhidrobiyotik organizmalar girdikleri "askı" durumu sırasında biyo-protektan olarak çalışan molekülleri sentezler. Örneğin, trehaloz ve sükroz, biyolojik zarı stabilize ederek protein açılımını ve membrana problemleri önler; geç embriyogenez bol proteinleri (LEA) ve ısı şoku proteinleri (HSP), hasarlı molekülleri onaran veya ortadan kaldıran şaperon sistemleri olarak çalışır, antioksidan moleküller ise oksidatif stresin olumsuz etkilerine karşı koymakta önemli rol alırlar.

Amisstome

Hem hidratlı hem de kurumuş tardigradların oksidatif stresin üstesinden gelmek için evrimsel süreç içerisinde kazandıkları dayanıklılık mekanizmasına sahip oldukları bilindiği için, TARDIKISS deneylerinde iyonlaştırıcı ve UV radyasyonlar gibi uzay stres koşullarına maruz kalmanın neden olduğu oksidatif stresin üstesinden gelmede antioksidan savunmanın rolünü değerlendirmek için kullanılmıştır. Tardigrade P. richters'ın aktif ve aç numuneleri ile yapılan ilk uzay deneyi (TARSE), antioksidan savunmalara dahil olan bazı enzimlerin uçuş streslerinden önemli ölçüde etkilendiğini göstermiştir. Özellikle, katalaz ve süperoksit dismutaz aktivitelerinde önemli bir azalma vardı, TARSE görevindeki aynı türe nazaran bu misyondaki P. richtersi'de enzimler daha aktif rol oynadı.

Ek olarak, bu türün strese girmemiş örneklerinde daha az aktif sistem olan glutatyon sistemi, uzay uçuşu sırasında önemli ölçüde uyarılmıştır. Bu sonuçlar, uçuş sırasında aktif ve metabolik olarak aktif hayvanların (mikro yerçekimi, açlık ve radyasyonlar) yaşadığı streslerle ilişkili olabilir. Aksine, TARDIKISS deneyinin kurutulmuş tardigradlarındaki antioksidan savunmaların analizi, TARSE deneyinin metabolik olarak aktif hayvanlarında kaydedilene benzer olsa bile, uzay uçuşu ile ilgili daha az farklılık göstermiştir. TARSE ve TARDIKISS deneyleri arasında benzer bir eğilim, uçuş görevindeki tardigradların laboratuvarı kontrol gruplarından (TC) sağ kalımda önemli farklılıklar göstermediği için sağ kalım açısından tutarlılık tespit edilmiştir. Sadece R. oberhaeuseri'de (TARDIKISS deneyi), F ve TC örnekleri arasında, c22:6 n-3 yağ asidi ve glutatyon redüktaz aktivitesinde ve diğer ROS süpürücü enzimlerin aktivitesinin azaldığı gözlemlenmiş ve bu türlerin hayatta kalma oranında da önemli bir azalma kaydedilmiştir.

Wallpaper13

Sonuç olarak, TARDIKISS deneyi, tardigradları kullanan önceki uzay deneyler ile birlikte, tardigradların uzay araştırmalarında kullanılabilecek canlılar olduklarını yeniden test etmiş ve kanıtlamıştır. Tardigradları kullanarak uzay araştırmasını daha da geliştirmek için, metabolik olarak aktif hayvanların maruz kaldığı durumlarda farklılığa gidilebileceğini ve aynı zamanda kurumuş tardigradları çıplak uzay ortamına maruz bırakma olasılığı olan deneylerin kurulması gerektiği düşünülmektedir.

Gerçek uzay koşulu altındaki deneyler, tardigradlar da dahil olmak üzere çok hücreli organizmaların uzay stresörlerinin kombine ve sinerjik etkilerinden hayatta kalmasına izin verebilecek mekanizmaların gerçekçi bir değerlendirmesini sağlar. Bununla birlikte, mikro yerçekimi, radyasyon, sıcaklık ve diğer uzay streslerinin simülatörlerini kullanarak Dünya'daki deneyler, gerçek uzay koşulları altında deneyleri tamamlayan uzay araştırmasının önemli bir parçasıdır. İki farklı veri kümesinin (yer ve uzay verileri) karşılaştırılması, canlı organizmaların uzay ortamı altındaki fizyolojik ve moleküler yollarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.