Tardigradların Genetik Hazinesi: Dsup Proteini

Tardigradlar, çok çeşitli fiziksel ve kimyasal aşırılıklara dayanma konusundaki yeteneği sayesinde tüm bilimseverleri büyülemektedir. Son dönemlerde tardigradların sahip olduğu dayanıklılık yeteneği, karşılaştıkları zorlu koşullar sırasında ifade edilen proteinlerin koruyucu rollerine odaklanmamıza sebep olmakla birlikte bu küçük omurgasızlara duyulan ilginin artmasına yol açmıştır.

Dsup (hasar önleyici) adı verilen ve tardigradlara özgü benzersiz bir proteinin DNA'yı radyasyon ve radikallerin ürettiği hasardan koruduğunun keşfi, biyoteknoloji ve tıp alanındaki potansiyel uygulamalarıyla ilgili beklentileri artırdı.

Bu yazımızda ele aldığımız makalede Dsup proteini ve DNA sistemi üzerinde "hesaplamalı deney" olarak adlandırılabilecek bir yöntem kullanıldı. Bu yöntem içerisinde moleküler modelleme, protein yapılarının elektrostatik potansiyelleri ve elektrik kaynaklarının hesaplamaları ve tüm atomlu moleküler dinamik simülasyonlar yer alıyordu. Araştırmacılar bahsedilen yöntemleri kullanılarak Dsup proteini ve DNA etkileşiminin dinamik görüntüsünü oluşturmayı başardılar. Sonuçlara değinmeden önce dilerseniz tardigradları ve Dsup proteinini tanıyalım.

Dünya'nın En Dayanıklı Hayvanları Tardigradlar ve Benzersiz Özellikleri

Hidrobiyoloji ve Tardigradlar yazı dizimizde detaylıca anlattığımız gibi, su ayıları olarak da bilinen tardigradlar, kara, tatlı su ve deniz habitatlarında bulunan yaklaşık 1.350’e yakın türü içeren özel bir filumdur (Tardigrada). Yaşamların büyük bir bölümünü su filminde geçiren bu etkileyici omurgasızların uzunlukları 0,1 ile 1 mm arasındadır. Değinildiği üzere karalara adapte olmalarına rağmen oksijen alımını sürdürmek için ince bir su tabakasıyla etraflarının çevrelenmesi gerekir. Suyun yokluğunda ise bugün ki yazımızı sizler ile buluşturmamıza sebebiyet veren o nadir yeteneğini gün yüzüne çıkartır. Tardigradlar, anhidrobiyoz adı verilen bir koruma durumu sayesinde neredeyse 10 yıla (güvenilir olmayan bazı verilere göre 30 yıl) kadar beslenme, boşaltım, üreme gibi yaşamsal faaliyetlerini gerçekleştirmeden yaşamlarını sürdürebilirler. Yeniden hayata dönmek için ise bir damla su onlar için yeterlidir.

Fakat onu eşsiz kılan şey sadece kurumaya olan dirençleri değildir çünkü bunu pek çok hayvan grubu gerçekleştirebilmekte, örnek olarak; rotiferler, nematodlar gibi hayvanlar aleminde desikasyona dirençli pek çok canlı vardır. Bilim adamlarını büyüleyen şey susuz kalmış tardigradların olağanüstü fiziksel ve kimyasal aşırılıklara dayanabilmeleriydi. -272^oC'ye kadar düşük veya +150^oC'ye kadar yüksek sıcaklıklarda birkaç dakika ve -20^oC'de on yıllarca hayatta kalabilirler. Tardigradlar vakumlu uzay ortamında 0 atm'ye veya Mariana Çukur’una inmek isterseniz deniz altınızın dayanması gereken yaklaşık basınç olan 1.200 atm'ye kadar yüksek basınca dayanmaktadır. Bazı türleri (Milnesium tardigradum) ise gama türündeki 4.000 - 5.000 Gy’e (Sadece 155 Gama tipindeki Gy 1.550.000 göğüs röntgenine eş değerdir) kadar yüksek radyasyon seviyelerindeki organik çözücüye daldırıldıktan sonra bile hayatta kalabilmektedir.

Cosmos

Bu benzersiz özellikleri sayesinde araştırmacılar yakınlardaki olası astrofiziksel felaketten (büyük asteroit çarpması, süpernova ve y-ışını patlamaları) tardigradların sağ çıkarak Dünya’daki mutlak yok oluşu olasılık dışı bırakacağını öngördüler. Sanırım bunun ne kadar doğru olduğunu bekleyip göreceğiz (göremedik). Aslında bu tür felaket senaryolarıyla karşılaşmadan da tardigradları bu zorlu çevre koşullarında test edebilme şansımız vardı. Elbette ki bu testler için bulutları aşıp çıplak uzay ortamı ile tardigradları buluşturmamız gerekiyordu - ki araştırmacılar öyle de yaptı. Tardigradlar 10 gün boyunca nispeten düşük yörüngede uzay boşluğuna maruz bırakılan ve sağ kalan ilk hayvanlar oldular. Bu da onları, yaşamın en zorlu koşullarına bile uyum sağlayan canlı gruplarından biri haline getirdi. Elbette bunun yanında, tardigradların zorlu koşullara göstermiş oldukları adaptasyonun mekanizmasını çalışmak paha biçilmez bir alan oluşturdu.

Tardigradlara Özel, Eşsiz Protein Dsup

Tardigradların bahsettiğimiz özellikleri büyük ilgi uyandırsa da, oldukça nadir görünen güçlerinin kaynağının arkasında genetik bir miras yatmaktaydı, üstelik bu miras tam anlamı ile aydınlatılmamış ve yeteri kadar çalışılmamıştı. Dsup (hasar baskılayıcı) adlı tardigradlara özgü benzersiz bir proteinin, insan hücrelerini X ışınlarının neden olduğu hasardan korumak için nükleer DNA ile ilişkilendirildiğine dair son keşif, biyoteknoloji ve tıpta tardigradlar üzerine yapılan çalışmaların hız kazanmasına ve kapsamının genişlemesine sebebiyet verdi.

Özellikle iki tardigrad türünün, radyasyona dayanıklılığı ile bilinen karasal türlerden biri olan Ramazzottius varieornatus ve radyasyona daha az toleransıyla bilinen tatlı su türlerinden biri olan Hypsibius exemplaris’in (daha önceki yayınladığımız yazılarımızdaki adıyla Hypsibius dujardini) genomları üzerinde yapılan analizler çalışmanın kapsamını genişletmiştir. Bu iki genomun karşılaştırmalı analizi, kuruma ve radyasyona farklı tepkileriyle ilişkili potansiyel gen mekanizmaları hakkında ipuçları sağlamakta ve araştırmacıların, aşırı toleransla ilişkili yeni mekanizmalar arayışında bunları açıklamalarına izin vermektedir.

ResearchGate

2017 senesinde radyasyona karşı en dayanıklı bir diğer tabir ile radyotolerant tardigradlardan biri olan R. varieornatus'un araştırmacılar tarafından yüksek kaliteli genom dizisi çıkarılıp Dsup proteininin (UniProt erişim numarası P0DOW4) analiz işlemleri gerçekleştirilmiştir. Dsup proteinini ifade eden hücreler kazandıkları radyoaktif korumanın yanında, dolaylı yoldan radyasyon etkileriyle üretilen reaktif oksijen türlerinden (ROS) biri olan hidroksil radikallerini oluşturan hidrojen peroksite maruz kalmıştır. Bu maruz kalmanın ardından DNA’da meydana gelen parçalanmaların herhangi bir canlı grubunda beklenenden oldukça az gerçekleştiği gözlemlenmiştir.

Fakat dizi temelli analizler ile Dsup proteininin DNA koruma mekanizmasının tam olarak açıklanamaması proteinin nükleer DNA ile spesifik olmayan bir şekilde birleştiğine ve DNA'yı doğrudan radyasyondan ve ROS hasarından fiziksel olarak koruduğuna yönelik önermeler sunulmasına yol açtı. Bu bildirinin ardından gerçekleşen onlarca çalışma oldu, bu çalışmalardan birinde araştırmacılar Dsup proteininin nükleozomlara bağlandığına ve kromozomal DNA'yı invitro DNA parçalanmasına aracılık eden hidroksil radikallerinden koruduğuna dair kanıtlar bildirdiler.

Bu kanıtlardan biri ise Dsup'ta yüksek hareketlilik grubu olan N (HMGN [transkripsiyon, replikasyon, rekombinasyon ve DNA onarımının düzenlenmesinde yer alan daha geniş yüksek hareketlilik grubu kromozomal protein sınıfının üyeleridir]) proteinlerinin nükleozom bağlama alanının çekirdek konsensüs sekansına benzerlik gösteren bir sekans bölgesi bulmalarıydı. İşin tuhaf tarafı yalnızca omurgalılarda bulunan bu proteinler, DNA dizisinden bağımsız olarak nükleozomlar üzerindeki afinitesi yüksek bölgelere bağlanıyordu.

Böyle bir durum ile karşı karşıya kalan araştırmacıların, ilgili protein olan Dsup proteininin homologlarını araştırması kaçınılmazdı. Bu yüzden tardigrada şubesinden bir diğer tür olan H. exemplaris ile bir karşılaştırma yapıldı. H. exemplaris'in Dsup proteinine sadece %24.5 gibi zayıf bir sekans özdeşliği gösteren bir protein tanımlandı.

ColdSpringHarborProtocols

Elde edilen verinin yanında hem proteinler için nükleer lokalizasyon tahmin edilmiş hem de C-terminal (bir serbest karboksil grubu tarafından sona eren bir amino asit zincirinin sonudur) alanlarında varsayılan bir nükleer lokalizasyon sinyali (NLS [bir proteini nükleer taşıma yoluyla hücre çekirdeğine ithal etmek için 'etiketleyen' bir amino asit sekansıdır]) dizisi tanımlanmıştır. Hizalama işlemleri ayrıca, bu iki protein arasında sıkı bir şekilde korunan iki kısa sekans motifini ortaya çıkarmayı başardı. Haliyle bu durum motiflerin Dsup proteininin işlevi için önemli olabileceğine dair spekülasyonlara yol açtı.

Araştırmacılar H. exemplar'dan elde edilen proteinde, HMGN proteinlerinin nükleozom bağlanması için kritik role sahip olan korunmuş çekirdek dizisine çok benzer bir dizi segmenti buldular. Nispeten benzer özellikler gösteren bu iki proteinden H. exemplaris'e ait olan proteine Dsup proteini gibi anlamı taşıyan “Dsup-“ etiketi verildi.

Bugünkü yazımıza konu olan asıl çalışmamızda, doğrudan DNA ve Dsup proteininin etkileşiminin moleküler ayrıntılarını keşfetmeyi amaçlamak adına Dsup proteininin yapısına odaklanıyoruz. Bu amaç doğrultusunda Dsup proteinine moleküler modelleme, Poisson-Boltzmann elektrostatik potansiyel (PB-EP'ler) analizi yapıldı. Daha sonra araştırmacılar elde edilen verilerin işlenmesi adına elektrik alanı ve moleküler dinamik (MD) simülasyonlarını kullandı. Bu ne işe yarayacak diye soracak olursanız ki sormalısınız. Bu çalışmalar Dsup proteininin moleküler düzeyde sahip olduğu katlanmaları, elektriksel çekim alanına vermiş olduğu tepkiyi ve buna bağlı olarak DNA’yı nasıl sardığını gözler önüne serecek simülasyonların oluşturulmasını sağlamaktadır.

Bunların dışında araştırmacılar pek çok yaklaşım daha uygulayarak olabildiğince tutarlı bir veri elde edip Dsup proteini ve DNA ilişkisini aydınlatmaya çalıştı. Bu yaklaşımlardan özellikle DNA ile iki Dsup molekülünün kompleksine yönelik yaklaşımı açıklamak için son derece yüksek bir veri ile karşı karşıya kalındı. Ortaya çıkan verinin boyutu yaklaşık 750.000'den fazla atom barındırıyordu. Tahmin edebileceğiniz gibi her atomun farklı konfigürasyonu simüle edileceğinden dolayı işlem gücü oldukça yüksek olan bir süper bilgisayara ihtiyaç duyuldu.

Jon Lieff, MD

Neredeyse tüm Dsup molekülünde yer alan C-terminalinde pozitif yük birikiminin yoğunlaştığı gözlemlenmiştir. Yüksek oranda yüklü aminoasitler içerdiği için araştırmacılar Dsup proteininin doğası gereği oldukça “kararsız” bir protein olduğu konusunda hem fikirdi. Bu bağlamda, yapılan çalışmada kullanılan elektrostatik yöntemlerin Dsup proteini ve DNA etkileşiminde çok önemli bir rol oynadığını vurgulamakta fayda vardır.

Çalışmadaki bir diğer önemli bulgu ise Dsup proteininin çeşitli bölgelerinin (esas olarak C-terminal segmentinde) DNA'ya olan kademeli yakınlığının kalkan benzeri bir ilişki sergilemesi. Bu çalışma tardigrad proteinlerinin olası dinamik etki modlarının atom düzeyinde ayrıntılarını aydınlatmayı amaçlayan ilk çalışmadır.

Çalışmanın Sonuçları

Yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlara odaklanılmak istenildiğinde R. varieornatus'tan elde edilen Dsup proteininin ve H. exemplaris'ten elde edilen Dsup- benzeri proteininin DNA'yı doğrudan veya dolaylı olarak radyasyon hasarından koruduğunu kesin bir şekilde kanıtlamıştır. Dsup geni 2017 senesindeki çalışmada olduğu gibi insan embriyonik böbrek hücrelerine aktarılmıştır. Aktarımın sonunda Dsup geninin ekspresyonunun, hücre canlılığını önemli ölçüde iyileştirdiği ve kontrol hücrelerine kıyasla X-ışınları ile ışınlama işlemine tabii tutulduktan sonra DNA ipliği kırılmalarını azalttığı gözlemlenmiştir. Bu koruyucu rol, hidrojen peroksitin neden olduğu radikal hasarını da kapsamaktadır.

Radyasyon ve radikaller, DNA üzerinde nasıl bir etki yaratıyor?

Hem iyonize radyasyon hem de hidrojen peroksit, hücrelerde önemli bir ROS ürünü olarak hidroksil radikallerini oluşturmaktadır. Bu yapıların oluşturmuş olduğu yüksek enerjili fotonların ve ikincil parçacıkların (elektronlar, iyonlar ve radikaller) doğrudan DNA’nın stabil kalmasını sağlayan pi-etkileşimli ve H-bağı etkileşimli bağların kırılmasına sebep olabileceği gibi hem birincil hem de ikincil etkileri fosfodiester bağlarının kopmasına neden olabilir. Bu da tek ve çift sarmallı kopmalarla ilişkili farklı parçalanmalara yol açmaktadır. Belirtilen bağların kopması ile mevcut DNA’nın yapısı bozulabilir ve hücre için hayati süreçlerin yapılmasına engel olunabilir.

Canadian Nuclear Safety Commision

Dsup ve Dsup- benzeri proteinler için önerilen nükleer lokalizasyon canlandırmasında her iki proteinin C-terminal alanında varsayılan bir nükleer lokalizasyon sinyali tanımlandı. Yapılan analizler sonrasında Dsup proteininin özellikle C-terminalinde oldukça bazik bir protein olduğunu ortaya çıktı. Araştırmacılar bu olgunun pozitif yüklü Dsup proteini ile negatif yüklü DNA arasındaki elektrostatik çekimin Dsup-DNA ilişkisini tetikleyeceğini öne sürdüler. Dsup proteininin N-terminali (bir polipeptidin sonunda bulunan serbest amin grubuna atıfta bulunan bir protein veya polipeptidin başlangıcıdır) ve orta bölgesinin neden olduğu Dsup-DNA komplekslerinin meydana gelmesi olası olumsuz etkileri hafifletmekte rol alabileceğini varsaydılar.

Daha önce yapılan çalışmalarda araştırmacılar Dsup'un yeniden oluşturulmuş mononükleozomlara bağlanmasını test etti ve Dsup'un nükleozomlara serbest DNA'dan önemli ölçüde daha yüksek bir afinite ile bağlandığını ve bu bağlanmanın DNA dizisinden bağımsız olduğunu buldu. Dsup proteininin aynı zamanda ayrı nükleozomlara benzer şekilde genişletilmiş nükleozom dizilerine bağlandığını ve ana nükleozom bağlayıcı histon H1'in eklenmesinin kromatin düzeneğini değiştirmediğini ve Dsup proteini ve histon H1'in aynı anda nükleozomlara bağlanabildiğini gösterdi.

Hidroksil radikallerinin zararlı etkilerine karşı koruma, serbest DNA ve kromatinde test edilmiştir. Araştırmacıların elde ettikleri sonuçlar, Dsup proteini korumasının kromatin ile korunan serbest DNA'dan daha güçlü olduğunu ortaya çıkardı ve bu da araştırmacıların proteinin muhtemelen oldukça dirençli bir yapı oluşturan nükleozomlara spesifik olarak bağlanabileceğini tahmin etmelerine yol açtı. Araştırmacılar ayrıca Dsup ve Dsup- benzeri proteininin C-terminalinde, HGMN proteinlerinin nükleozomlara bağlanması için kritik olan bir dizi motifi tanımlamış ve kromatini hidroksil radikal aracılı DNA hasarından korumak için gereken nükleozom bağlanması için önemini göstermiştir.

Amisstome

Hesaplamalı çalışmalar, Dsup proteini yapısının DNA ile birleşebilmek için evrimsel süreçte yüksek bir esneklik kazandığı düşündürmektedir. Aynı zamanda yapısı gereği bozuk olarak tabir edilmesi Dsup-DNA etkileşiminde çok önemli bir rol üstlenmesine sebep olmaktadır. Dsup proteininin bozuk segmentlerindeki aminoasitlerin belirli bir yapıyı korumak için kısıtlama olmaksızın değişebilmektedir. Dsup ve Dsup- benzeri dizilerin nispeten aynı görevi üstlenmelerinin yanında neden çok düşük benzerliğe sahip oldukları ve buna rağmen temel düzensizlik kodlama modelini korudukları düşündürücüdür. Fakat ilgili proteinlerin çıkarma işleminin yapıldığı canlılar düşünüldüğünde (Dsup-karasal R. varieornatus, Dsup-sucul H. exemplaris) ise farklı ortamlara gösterilen evrimsel adaptasyonun bu farklılaşmaya sebep olduğunu düşünmekteyiz.

Moleküllerin, Proteinlerin Yapısındaki Bozukluklara Sıkça Rastlanmakta mı?

Tam proteinlerin yanı sıra alanlar ve bölgelerdeki içsel bozukluk, DNA ve RNA bağlanmasında özellikle sıktır. Düzensiz N-terminal kuyruklarının verimli DNA taramasına katkıda bulunduğu bilinmektedir ve düzensiz C-terminal kuyrukları genellikle transkripsiyon faktörlerinde ve DNA bağlanma aktivitesiyle ilişkili proteinlerde mevcuttur. Örneğin, Ets-1 transkripsiyon faktörünün düzensiz bölgelerinin, bağlanma segmentinin esnekliğinden dolayı DNA bağlanma afinitesini 100-1,000 kat arttırdığı bildirilmiştir. Bozukluk, histon ailesinde de oldukça yaygındır. Ana nükleozom bağlayıcı histon olan H1'in C-terminal alanı, nükleozomlar arasındaki bağlayıcı DNA yoluyla kromatin oluşumunda rol oynayan düzensiz segmentlere sahiptir. Nükleozomları oluşturmak için DNA ile birleşen çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4'ün kuyrukları da doğal olarak düzensiz bölgelerdir. Daha önce yapılan pek çok farklı çalışma ile yüksek derecede bozukluğun, çekirdek histonlarının çeşitli genetik süreçleri düzenleyen anahtarlar olarak işlev görmesine izin verdiği öne sürülmüştür ve 2.000'den fazla histonun hesaplamalı analizi, bunların çoğunun büyük düzensiz bölgelere sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Akademik Sunum

Moleküler Modelleme Çalışmaları Bizlere Hangi Bilgileri Kazandırmayı Başardı?

Bu çalışmada sunulan MD sonuçları, düzensiz yapıdaki Dsup proteininin bazik aminoasitlere sahip olmasından dolayı pozitif yüklüdür ve bunun karşısında DNA'nın fosfat yapısına bağlı olarak negatif yüklü olması iki bileşik arasındaki elektrostatik çekimim birbirini tetiklemesine ve birbirine yaklaştığını göstermektedir. Dsup proteinin etkileşim yüzeyinin büyük bir bölümü ile tüm DNA yüzeyi arasındaki elektrostatik tamamlayıcılık, her iki molekül birbirine daha yakın olduğu anlarda çok daha güçlü hale gelir. Zıt yükler arasındaki çekimin gerçekleşmesi koşuluyla, literatürde belirtilen Dsup-DNA ilişkisinin özgül olmaması, belirli aminoasit ve nükleotid dizilerine bakılmaksızın meydana geldiği şeklinde yorumlanmalıdır.

Dsup proteininin sert bir mimarisinin olmaması ve yüksek esneklik, Dsup'un bazı DNA bölgelerindeki konformasyonel değişikliklerden bağımsız olarak, kalkan benzeri bir ilişki içinde yapısını DNA'ya ayarlamasını sağlar. Bu ayrıntı, Dsup'un hem serbest DNA hem de nükleozomlar için gözlemlenen koruyucu rolünü açıklamakla ilgili olabilir. Elde edilen sonuçlar, yüksek esnekliğin, Dsup'un nükleozomlarda çekirdek histonların etrafını saran diskoid DNA'nın bükülmüş yapısına uymasına izin vereceğini göstermektedir. MD verileri ayrıca, karşılıklı elektrostatik çekimlerinin bir sonucu olarak birbirlerine yaklaştırıldıklarında Dsup ve DNA'nın geniş yüzey bölümlerinin birleşmesini de ortaya koymaktadır; bu, koruma mekanizmasının nicel açıklamasında da dikkate alınmaya değer bir ayrıntı olma özelliği taşır.

İlgili çalışmanın görsel verilerine, moleküler etkileşim analizlerine ve modellemelerine aşağıda yer alan kaynaktan ulaşabilirsiniz.

Tardigradların Sahip Oldukları Bu Üst Düzey Korunma Mekanizmasını Aydınlatmaya Bir Adım Daha Yaklaştık!

Özetlemek gerekirse, araştırmacıların gerçekleştirmiş olduğu bu çalışmada sunulan hesaplama çalışması, Dsup proteininin DNA ile spesifik olmayan bir şekilde bağlandığına, DNA'yı doğrudan radyasyondan ve ROS hasarından fiziksel olarak koruduğuna ve ayrıca Dsup-nükleozom etkileşimleri hakkında daha önce yapılan çalışmalara destek verdiği görülüyor. Sonuçlardan ortaya çıkan resim, Dsup proteininin içsel bozukluğunun ve protein ile DNA arasındaki güçlü elektrostatik çekimlerin, Dsup ve DNA ile yakından ilişkili olan esnek kümeleşmenin oluşmasını tetiklediği görülüyor.

Dsup proteininin yalnızca yapısal destek sağlamakla kalmayıp aynı zamanda elektriksel koruma sağlayarak DNA'yı radyasyondan ve ROS hasarından koruması gerektiğini düşünmek de araştırmacılara oldukça cazip geliyor. Bu kalkanın doğası gereği yüksek esnekliği, kompleksin Dsup proteininin büyük bölümlerinin hareketini artırarak DNA hasarı üretmesi gereken enerji ve parçacıkların etkisini absorbe etmesine izin verdiği düşünülüyor. İçsel bozukluk, Dsup proteininin etkileşim mekanizmasının benzersiz bir resmini elde etmeyi engellese de, zamanla değişen bir konformasyonlar topluluğu olarak var olduğundan, DNA'ya olan çekiciliği boyunca yapısının dinamik evrimi, potansiyeli hakkında bizlere bilgi sağlıyor. Hala tam anlamı ile aydınlatılamayan Dsup proteini araştırmacıların bu olağan üstü emek isteyen çalışması ile bu alanda büyük adım atılmış oldu.