Bakteriyofaj Nedir? Virüsler, Gıda Endüstrisinde Nasıl Kullanılmaktadır?

Bakteriyofaj (veya kısaca faj), Eski Yunancada "bakteri yiyen" anlamına gelmektedir ve literatürde bakteri virüsleri olarak adlandırılmaktadır. Geleneksel olarak, virüslerin cansız olduğu kabul edilir; çünkü canlılık tanımlarının gereksinimlerini karşılamazlar. Buna rağmen, canlılığa absürt derecede benzer özellikleri dolayısıyla kimi zaman canlılar gibi kategorize edilebilirler. Örneğin eğer virüsler canlı olsalardı, yaklaşık 10³¹ mertebesindeki popülasyon büyüklükleri sayesinde bilinen en çeşitli ve mevcut en fazla biyolojik yaşam formu olurlardı.

Fajlar, insan da dâhil olmak üzere memeli hücrelerini enfekte edemezler; bakterilerin hücre içi zorunlu parazitidirler. Dolayısıyla konakçıdan ayrılmalarıyla yaşamsal faaliyetleri durur. Bakteriyofajların kendine özgü ilginç bir özgüllüğü vardır ve bu özelliği ile sadece kendine has spesifik bakterileri hedef alarak onları enfekte ederler. Bulundukları ortamdaki doğal mikrofloraya (örneğin insan bağırsak mikroflorasına) zarar vermezler.

Fajlar, konakçılara kıyasla çevresel stres etmenlerine karşı daha dirençlidirler. Örneğin, konakçıya kıyasla daha geniş bir sıcaklık aralığında çoğalıp canlı kalabilirler. Ancak yine de belli bir sıcaklık değeri, pH, bazı iyonların varlığı (Ca⁺² veya Mg⁺² gibi), tuz konsantrasyonu gibi etmenler çoğalmaları, enfeksiyon oluşturmaları veya depolanmaları üzerinde etkilidir.

Fajların yaşam döngüleri kısa olup DNA veya RNA'ya sahip basit yapılı virüslerdir. Fajlar toprak, su, taze gıdalar, canlı/ölü hayvan ve bitkiler ve insan bağırsak sistemi gibi bir konakçının bulunabileceği her yerde bulunabilirler. Bakteriyofajların her 48 saatte, dünyadaki bakterilerin yaklaşık olarak yarısını yok ettikleri öngörülmektedir.

İlk kez 1986 yılında Ernest Hankin tarafından koleraya sebep olan Vibrio cholera’ya karşı antibakteriyel bir aktivitenin varlığı raporlanmıştır. 1915 yılında ise Frederick Twort bir "virüse" bağlı antibakteriyel aktivitenin olabileceğini iddia etmiştir; fakat Twort, bu hipotezinin devamını getirememiştir. Bu hipotezi takiben bakteriyofajlar, 1917 yılında Felix d'Herelle tarafından ilk kez resmen keşfedilmiştir. 1925 yılına gelindiğinde d'Herelle, vebanın (4 tip) "antiveba" fajları ile tedavi ettiğini rapor ederek, faj terapisine dikkatleri çekmeyi başarmıştır. Ancak 2. Dünya Savaşı sonrasında, antibiyotiklerin keşfedilmesiyle beraber, bu doğal ajanlara karşı ilgi azalmış ve uzun yıllar uygulama alanı bulamamıştır. Fakat bu süreçte eski Sovyetler Birliği ile Gürcistan'da faj terapi uygulamalarına devam edilmiştir.

Günümüzde ise antibiyotik üretimi ve kullanımının küresel boyuttaki maliyeti, enerji sarfiyatı ve özellikle ciddi bir global halk sağlığı sorunu haline gelen "antibiyotik direnci", bakterilere (özellikle patojenlere) karşı korunmada birçok branşta faj tedavisinin kullanılmasını zaruri bir ihtiyaç haline gelmiştir. Günümüzde fajlar, aşağıdaki alanlarda kullanılmaktadır:

• Tıp ve Diş Hekimliği
• Ziraat ve Gıda Endüstrisi (Gıda güvenliği)
• Veterinerlik ve Hayvancılık
• Su ve Çevre Güvenliği (Kirliliği önleme ve atık suyun geri kazanılması)
• Biyosavunma
• Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji

Bu içerikte, fajların gıda endüstrisinde; özellikle gıda kaynaklı patojenlerle mücadelede ve gıda güvenliğini sağlamada kullanımı üzerinde durulacaktır.

Fajların Morfolojisi ve Çalışma Mekanizması

Fajlar, genetik materyal olarak DNA veya RNA içermekte ve proteinden oluşmaktadırlar. Sadece bir kısmı lipit içerir. Dolayısıyla kendi metabolik sistemleri ve ribozomları bulunmadığı için protein sentezleyemez ve hiçbir genetik bilgiyi kendi başlarına üretemezler. Bu nedenle bir konakçıya ihtiyaçları vardır. Diğer virüslerle benzer olarak, sadece enfeksiyon oluşturduklarında çoğalıp, konakçıdan ayrıldıklarında metabolik faaliyetleri durur.

Bir faj, genel olarak sırasıyla baş, boyun, kuyruk ve kuyruk uzantılarından meydana gelir:

Wikimedia Commons

Fajların hepsinde ya çift sarmallı ya da tek sarmallı genom (DNA veya RNA) bulunur. Nükleik asit çeşidine ve morfolojik özelliklerine göre altı grupta toplanırlar (A'dan F'ye kadar). Genomlar ise "kapsit" olarak adlandırılan protein ya da lipoprotein yapıdaki bir kılıf içerisindedir.

Faj, konakçıya denk geldiğinde, farklı hücre yüzey bileşenlerinden biriyle (oligosakkarit, peptidoglikan, protein, lipopolisakkarit vb.) konakçısına bağlanır. Bu bağlanma işlemi geri dönüşümsüz olup, fajın kendi genetik materyalini replike edip, protein sentezi başladıktan sonra replikasyonu tamamlanan genetik materyal kapsit içine paketlenir ve kuyruk kapsit ile birleşir.

Fajların iki farklı yaşam döngüleri vardır:

• Litik Döngü
• Lizojenik Döngü

Litik Döngü

Bu döngüye sahip fajlara "virülent faj" denir. Faj terapi uygulamalarında genellikle bu gruptaki fajlar tercih edilir. Çünkü bir faj konakçısına tutunup bakteri hücresini lize ettikten sonra ortalama 200 adet yeni yavru faj (viron) ortaya çıkmaktadır. Litik döngü altı kademede gerçekleşir:

1. Fajın konakçıya tutunması (adsorpsiyon)
2. Fajın konakçıyı delmesi (penetrasyon)
3. Faj genomunun ve proteinlerin sentezi (replikasyon)
4. Yeni vironların oluşması (maturasyon)
5. Konakçı hücrenin lize olarak vironların ortaya çıkması (salım)
6. Bu yeni fajların yeni konakçıları enfekte etmesi (re-enfeksiyon)

Lizojenik Döngü

Bu döngüye sahip fajlara "temperent faj" denir. Bu döngüde de fajın tutunma ve genetik materyalini replike etme sistemi litik döngüdeki gibidir, ancak lizojenik fajlar bakteriyel lizizi gerçekleştirememektedirler. Bu nedenle lizojenik fajlar, faj terapide tercih edilmezler.

Faj Seçimi, İzolasyonu ve Saflaştırması Nasıl Yapılır?

Fajların izole edileceği örnekler, konağın bulunduğu ortamlardan toplanmaktadır. Bu ortamlar genellikle toprak, su, atık su arıtma tesisleri, bitki atıkları veya dışkıdır. Örneğin dışkı kaynaklı bir patojene karşı kullanılacak fajlar, ya dışkıdan ya da kanalizasyon suyundan izole edilir. Fajların izolasyon yöntemleri farklılık gösterse de temelinde toplanan numunelerden faj varlığının tespiti yer alır.

Journal of Applied Microbiology

Bir bakteriyofajın konak aralığı değişkenlik gösterir. Bazı fajlar sadece birkaç suşu enfekte ederken ("dar konak aralığı"), bazıları ise aynı türe ait birçok suşu enfekte edebilirler ("geniş değerli konak aralığı"). İzolasyondaki temel yöntem Felix d'Herelle tarafından geliştirildiğinden beri değişmemiştir. Bu yönteme zenginleştirme prosedürü denmektedir:

• Bir bakteri örneği, bir çevresel numune ile (dışkı, atık su vb.) karıştırılır ve karışım tipik olarak bir gece inkübe edilir.
• Çoğalan bakteriler bu ortamdan santrifüjleme ve/veya filtrasyon metodu ile izole edilir ve fajların varlığına dair teste tabi tutulur.
• Tanımlanan herhangi bir faj, daha sonra faj tedavisi için istenen özelliklere sahip olup olmadığını belirlemek için karakterize edilir. İşe yararlılıkları faj virülansına, etkiledikleri konak aralığına, litik veya diğer yaşam döngülerine vb. bağlıdır. Genellikle izolasyon sırasında bu özelliklerin çoğunu tarayabilmek zordur. Dolayısıyla istisnalar olsa da karakterizasyon daha sonra yapılır.

Bazı araştırmacılar, zenginleştirme metodu kullanmadan da fajları izole edebilirler; çevresel numuneler, daha önce izole edilmiş bir faj ile inoküle edilip plak oluşumu veya temiz bölge oluşumu gözlenerek yapılır.

Fajların Gıda Sektöründe Kullanımı

Sürekli artan dünya nüfusu ve buna bağlı olarak artan gıda tüketimi, endüstriyel boyutta "güvenilir" ve tüketim açısından "güvenli" gıdaya ulaşımda zorluklara sebep olmaktadır. UNDESA'nın (Birleşmiş Milletler Ekonomik ve Sosyal İşler Bölümü) 2019 yılında bildirdiği verilere göre, dünya nüfusunun 2050 yılında kadar 9,7 milyara, 2100 yılına kadar ise 11,2 milyara kadar çıkması beklenmektedir.

Bu artış, endüstriyel boyutta özellikle patojenlerle mücadelede gıda güvenliği ve paralelinde halk sağlığı açısından küresel çapta bir çözüm arayışına ihtiyaç duymamıza neden olacaktır - ki var olan güncel bilgiler, bu çözüm arayışına kanıt oluşturur niteliktedir; çünkü WHO'ya (Dünya Sağlık Örgütü) göre, 2020 yılında küresel çapta yıllık 600 milyon kişinin gıda kaynaklı hastalıklar nedeniyle etkilendiğini ve 420 bine kadar ölümle sonuçlanan vakanın olduğunu tahmin edilmektedir.

Güvenli gıdanın temelinde bir çok faktör yer almaktadır. Bir gıda işletmesinde hammaddenin kabulünden tüketicinin evine ulaşan son ürüne kadar üretim, depolama ve sevkiyatın her aşamasının güvenilir olması zorunludur. Son ürünün tekstürel (tat, koku, doku, görsellik) özelliklerinin ve besin kalitesinin korunmuş olmasının yanı sıra patojenlerden de uzaklaştırılmış olması gerekir.

Günümüzdeki ileri üretim teknolojileri sayesinde her ne kadar gıda üretim sürecinin tüm aşamalarında, gıda kaynaklı patojenlerin tespiti ve eliminasyonu için bir çok yöntem geliştirilmiş olsa da patojenlerle mücadele hala küresel boyutta ciddi bir halk sağlığı ve ekonomi sorunudur. Yakın zamanda, Evrim Ağacı olarak ayrıntılı yer verdiğimiz Ferrero'daki Salmonella salgınını hatırlatmakta fayda var. Ayrıca FDA, CDC veya EFSA gibi kuruluşların web sayfalarında yer alan salgınlar incelendiğinde çok çarpıcı sonuçlarla karşılaşılacaktır. Sadece FDA'nın (Amerika Gıda ve İlaç Dairesi Başkanlığı) 2022 yılında raporladığı 8 farklı salgın mevcut olup, salgınla ilişkili gıdalar arasında camambert ve brie peyniri, donuk falafel, dondurma, çilek, fıstık ezmesi, toz bebek maması ve paketlenmiş salata gibi birçok farklı gıda yer alırken, salgına sebep olan patojenler arasında Listeria monoctogenes, Escherichia coli, Hepatit A, Salmonella gibi birden çok patojen yer almaktadır.

USDA'nın (ABD Tarım Bakanlığı) 2021 yılında yayınlamış olduğu rapora göre, 2013 ile 2018 yılları arasında gıda kaynaklı salgınların sebep olduğu ekonomik kayıp 2 milyar $ artış göstermiştir. ABD'de sadece 2018 yılında, beş patojen bakteri kaynaklı farklı salgınlarla mücadelede yaşanan mali kayıp toplamda 15,7 milyar $ civarındadır.

Tedavi sürecinde, patojenlere karşı hastaya uygulanan antibiyotik tedavisi ile ilgili en ciddi handikap ise antibiyotiğe veya birden çok antibiyotik grubuna dirençli patojenlerdir (MDR pathogens). Dolayısıyla, günümüzde özellikle antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadelede doğal biyokontrol ajanlarının araştırılması ve endüstriyel boyutta uygulama alanlarının genişletilmesi elzem olmuştur - ki bunlardan biri bakteriyofajdır.

Son yıllarda, özellikle Listeria monocytogenes, Escherichia coli ve Salmonella serovarları dahil birçok gıda kaynaklı patojeni kontrol altına almak için endüstriyel çapta FDA tarafından GRAS ("genel olarak güvenilir zararsız kabul edilen") statüsüne sahip birden çok faj-bazlı preparat geliştirilmiştir.

Frontiers

Gıda endüstrisinde faj kullanımı üç aşamaya ayrılmaktadır:

1. Besicilikte, besi hayvanlarına doğrudan faj uygulaması yapılarak, kesim sırasında hayvan karkasından gelebilecek olası patojenleri (E. coli, Salmonella, S. aureus vb.) önlemek.
2. Gıda üretim işletmesindeki ekipman ve yüzeylere faj uygulaması yaparak kazan, tezgah, taşıma bandı vb. yüzeylerden gelebilecek patojen kontaminasyonunu elimine etmek.
3. Gıda üzerine doğrudan faj uygulamak.

Gıda üzerine doğrudan faj uygulamasını birkaç örnekle ayrıntılandıralım: Vikram ve arkadaşlarının, spesifik olarak Shiga toksin üreten E. coli'yi hedef alan Intralytix faj kokteyli üzerinde yaptıkları çalışmada; kızartılmış sığır eti, kıyma, tavuk göğsü, pişmiş tavuk, somon, peynir, kavun ve marul dahil sekiz farklı gıdada patojen sayısını 3 log kob/gr oranında azalttığını tespit etmişlerdir.

Wong ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir başka çalışmada, marul yaprakları ve kavun üzerinde beş bileşenli bir faj kokteyli kullanarak yedi farklı Salmonella serovarı üzerinde oluşan etkiyi incelemişlerdir. Kullanılan faj kokteyli, gıda örneklerine Salmonella serovarlarının inoküle edilmesinden 24 saat önce uygulanmıştır. Sonuçlar, farklı Salmonella serovarları üzerinde önemli farklılıklar olduğunu ve fajların Salmonella biyokontrolünde başarı potansiyeli olduğunu göstermekle birlikte, başarı oranının bakteri suşuna bağlı olarak değiştiğini de göstermiştir.

Thung ve arkadaşları meyve suyu, taze yumurta, sığır eti ve tavuk dahil olmak üzere farklı perakende gıdalar üzerinde anti-Salmonella enteritidis faj SE07'nin biyokontrol potansiyelini incelemişler ve 4 C'de 48 saatlik sürenin ardından bakteri sayısında 2 logaritmalık bir düşüş olduğunu saptamışlardır.

Faj Kullanımının Avantajları

Faj kullanımının avantajları şu şekilde sıralanabilir:

• Bakteriyofajlar patojene özgü hızlı çoğalan biyolojik varlıklardır ve gıda mikroflorasını olumsuz yönde etkilememektedirler. Özellikle bu yönleri ile gıda güvenliği açısından müthiş bir avantaja sahiptirler.
• Fajların patojenlerle mücadelede kullanılması çevresel olarak herhangi bir kirlilik veya olumsuzluk yaratmamaktadır.
• Faj preparatları hazırlanırken herhangi bir katkı maddesinin kullanımına ihtiyaç olmadığı için maliyeti düşüktür.
• Direnç geliştirmiş bakterilerle karşılaştıklarında kendileri de değişime uğrayarak yine bakteri gelişimini engelleme yeteneğindedirler. Fajlara karşı direnç gösteren bakterilere karşı ise faj kokteyli kullanılarak yine patojenle mücadelede başarılı sonuçlar vermektedirler.

Sonuç

Fajların, diğer antimikrobiyallere kıyasla sahip olduğu kendine özgü ve güvenilir bu avnatajları göz önünde bulundurulduğunda, gıda kaynaklı patojenlerle ve oluşturdukları hastalıklarla mücadelede her ne kadar nihai çözüm olarak görülmese bile, farklı stratejilerle beraber kombinasyon halinde kullanılmaları kayda değer bir potansiyel ortaya çıkarmaktadır.