Cryo-Elektron Mikroskopi Yöntemi, Atomları Tek Başına Görüntülemek İçin İlk Kez Kullanıldı!

Moleküllerin görüntülenmesinde yenilikçi bir teknik olan cryo-EM, şu ana kadar bu teknikle elde edilebilen en net görüntüleri üretti ve ilk defa proteinlerin yapısında bulunan atomları ayırt edebilecek çözünürlüğe ulaştı.

Araştırmacılar, cryo-EM kullanılarak elde edilen atomik çözünürlük daha önce diğer teknikler ile, mesela X-ray kristallografisi ile kolayca incelenemeyen proteinlerin çalışma mekanizmaları ile ilgili bilgi edinebilecekler.

Araştırmacılara göre, Mayıs 2020’de raporlanan bu atılımla beraber; cryo-EM, proteinlerin 3 boyutlu modellemesinde daha da önemli bir yer edindi. Bu 3 boyutlu yapılar proteinlerin hastalıkta ve sağlıkta nasıl çalıştıklarının anlaşılmasını sağlayacak ve bununla beraber daha az yan etkiye sahip ilaçlar üretilebilecek.

Almanya, Göttingen’de Max Planck Biyofiziksel Kimya Enstitüsü’nde mikroskopist ve biyokimyacı olarak görev alan ve çalışmalardan birinin liderliğini üstlenen Holger Stark şöyle diyor:

Bu önemli bir dönüm noktası, bu kesin. Artık kırılabilecek başka bir bariyer yok, bu ulaşılabilecek en son çözünürlük bariyeriydi.

Diğer çalışmanın liderleri ise Birleşik Krallık, Cambridge’de bulunan Moleküler Biyoloji Medikal Araştırma Konsey Laboratuvarı’nda yapısal biyolog olarak çalışan Sjors Scheres ve Radu Aricescu. İki çalışma da bioRxiv’de 22 Mayıs 2020’de yayınlandı.

Kanada’da Toronto Üniversitesi’nde yapısal biyolog olarak görev alan John Rubinstein da “gerçek atomik çözünürlüğün bir dönüm noktası” olduğunu belirtti. Başka zorluklar sebebiyle, mesela proteinin esnekliği, birçok proteinin atomik çözünürlükte yapılarını elde etmek önemli bir sorun olmaya devam edecek.

Bu yayınlar eğer bu zorlukların üstesinden gelinirse nereye varabileceğimizi gösteriyor.

Duvarları Yıkmak

Cryo-EM on yıllardır kullanılan bir teknik. Temel olarak, ani bir şekilde dondurulmuş örneklere elektron ateşlenmesiyle oluşturulan görseller kullanılarak moleküllerin şeklini ortaya çıkarıyor. Bu devrimle beraber protein yapıları önceden olduğundan çok daha net bir şekilde, hatta daha eski bir yöntem olan ve protein kristallerinin X-ray ile bombardımanı sonucu oluşan difraksiyon biçimlerini yorumlayan X-ray kristallografi yönteminden elde edilen görüntülere yakın bir netlikte görüntüler elde edildi.

Nature

Takip eden donanım ve yazılım gelişmeleriyle cryo-EM yapılarının çözünürlüğü daha da gelişti. Ancak, bu gelişmelere rağmen araştırmacılar atomik düzeyde çözünürlüğe sahip görüntüler elde etmek için X-ray kristallografi yöntemine güvenmek zorundalardı. Bu yöntem de araştırmacıların bir proteini kristalize etmek için aylarca çalışmasını gerektiriyordu. Üstelik birçok medikal önemi olan protein kullanılabilir kristaller bile oluşturmuyordu. Buna karşın cryo-EM, proteinin saf bir çözeltisiyle çalışabiliyor ve X-ray kristallografi için gerekli kristalizasyon süreçlerini gerektirmiyor.

Atomik-çözünürlükteki haritalar, atomların protein içindeki yapısını yaklaşık 1.2 angstrom ($1.2\ast 10^{-10}$ metre) çözünürlükte net bir şekilde saptayabiliyor. Bu yapıların elde edilmesi enzimlerin çalışma mekanizmalarını kavramak ve bu bilgiyi enzimlerin aktivitesini durdurmak adına kullanmak için oldukça kullanılışlı.

Bu iki takım, cryo-EM tekniğini atomik çözünürlüğe taşımak için demir depolama ile görevli bir protein olan apoferritin ile çalıştı. Apoferritin, kaya gibi sert yapısıyla cryo-EM çalışmaları için önemli bir protein, bundan önce bu proteinle ulaşılan en yüksek çözünürlük 1.54 angstromdu.

Takımlar, teknolojik gelişmeleri kullanarak apoferritinin daha net resimlerini oluşturmaya çalıştılar. Stark’ın takımı 1.25 angstromluk bir yapıya ulaştı. Bunu yaparken de ateş edilen tüm elektronların aynı hızda hareket etmesini sağlayan ve bunun sonucunda görüntülerin çözünürlüğünü artıran bir enstrüman kullandı. Scheres, Aricescu ve takımları da elektronların aynı hıza sahip olmasını sağlayan bu enstrümanla beraber, proteine çarpmadan ilerleyen elektronların yarattığı gürültüyü azaltan bir teknoloji ile birlikte daha yüksek elektron duyarlılığına sahip bir elektron seçici kamera kullandılar ve sonuç olarak 1.2 angstromluk bir yapı elde ettiler. Scheres, çalışmaların sonucunda ortaya çıkan yapıda bireysel hidrojen atomlarının hem protein içerisinde hem de onu çevreleyen su molekülleri içerisinde görüntülenebildiğini aktardı.

Stark’a göre bu teknolojileri birleştirmek çözünürlüğü 1 angstroma kadar yükseltebilir, bundan fazlası ise mümkün değil, “1 angstrom altında bir çözünürlüğe cryo-EM ile ulaşmak neredeyse imkânsız.” O çözünürlükte bir yapıya şu anki teknoloji ile ulaşmak “yıllarca süren bir veri kaydı, gerçekçi olmayan miktarda bir bilgisayar gücü ve veri depolama kapasitesi gerektiriyor.”

Net Görüş

Scheres ve Aricescu gelişmelerini daha basit protein olan GABA_A reseptörü üzerinde de denediler. Bu protein nöron zarları üzerinde bulunuyor ve genel anestezi, anksiyete ilaçları dahil olmak üzere birçok farklı ilacın hedef aldığı bir reseptör. 2019 senesinde Aricescu ve takımı bu proteini 2.5 angstrom çözünürlükte haritalandırabilmişti, yeni kit ile beraber araştırmacılar 1.7 angstrom -proteinin bazı bölümlerinde daha da yüksek- çözünürlüğe ulaştı. Aricescu bu çözünürlükte her yarım angstromun yeni bir evrene geçişmiş gibi bir ilerlemeye sebep olacağını belirtti.

Bu yapı, daha önce bu proteinde hiç görülmemiş -histamin adı verilen bir molekülün içine oturduğu bir cebin içinde bulunan su moleküllerinin görüntülenmesi gibi- detayları da ortaya koydu. Aricescu’ya göre “Bu yapıya bağlı ilaç dizaynında bir altın madeni sayılabilir.” çünkü bu, bir ilacın su moleküllerini nasıl yerinden edebileceğini ve [Ç.N.: ilaç ile reseptörün daha uyumlu bağlanmasını sağlayarak] daha az yan etkili ilaçlar oluşturma potansiyeli olduğunu gösteriyor.

[Ç.N.: Bu gelişimler ilaçların vücut tarafından nasıl bir değişikliğe uğratıldığı (farmakokinetik özellikler) ve ilacın vücut üzerinde nasıl bir değişiklik yaratarak etki ettiği (farmakodinamik özellikler) üzerinden incelenirse daha iyi anlaşılabilir. Bir ilacın reseptöre daha iyi bağlanması onun etkisini arttırmasını sağlarken aynı zamanda kandaki konsantrasyonunu ve yarılanma ömrünü de değiştirebilir. Sonuç olarak bir ilacın reseptöre daha iyi bağlanabilmesini sağlayan bir gelişme, burada cryo-EM çalışması, hem ilacın istenen etkiyi yaratması noktasında hem de bu ilacın vücuda başka zararlar vermeme noktasında değişikliklere sebep olur.]

Scheres’a göre apoferritinden daha az stabil olan GABA_A yapısının atomik çözünürlükte bir görüntüsünü oluşturmak oldukça zor.

Bunun imkânsız olduğunu düşünmüyorum, ancak buna ulaşmak oldukça verimsiz olacaktır.

Bunun sebebi ise, kaydedilmesi gereken yüksek veri miktarı. Ancak diğer -özellikle protein örneklerinin hazırlanmasındaki- gelişmeler, GABA_A reseptörü ve diğer biyomedikal önemi olan proteinlerin atomik çözünürlükte görüntülerinin oluşturulmasının önünü açabilir. Protein çözeltileri altın ızgaralarda dondurulur ve bu ızgaralarda yapılacak değişikler proteinlerin daha da stabil duruma gelmesini sağlayabilir. 

Tokyo Üniversitesi cryo-EM uzmanı Radostin Danev’e göre örnek hazırlanması özellikle daha hareketli proteinler için bu alandaki en önemli problem. Şöyle diyor:

Dolayısıyla 1.5 hatta 2 angstrom altı çözünürlükteki performanslar bir süre daha sadece belirli, daha iyi davranışlı örnekler için mümkün olacak.

Scheres’a göre ise:

Bu gelişmeler büyük ihtimalle cryo-EM’nin yapısal çalışmalardaki yerini güçlendirecek.

Atomik çözünürlükte yapılara ihtiyacı olan ilaç firmaları cryo-EM çalışmalarını daha çok tercih etmeye başlayabilir. Stark’a göre ise X-ray kristallografi bir süre daha çekiciliğini koruyacak. Eğer bir protein kristalize olabiliyorsa- ki bu önemli ve her zaman sağlanamayan bir koşul- X-ray kristallografisi görece daha verimli bir araç olacaktır. Buna karşın cryo-EM ile yüksek çözünürlükte görüntüler oluşturmak için gerekli veriyi toplamak saatler ve hatta günler alabilir. 

Stark’a göre her iki teknik için de avantajlar ve dezavantajlar mevcut. Sözlerini şöyle tamamlyıor:

Araştırmacılar cryo-EM’deki son gelişmelerin X-ray tekniği için bir ölüm sinyali olduğunu düşünüyor, ben bu konuda şüpheliyim.