Proteinlerin Şekilsel Benzerliği Nasıl Tespit Edilir?

Kol ve bacak kaslarınızda benzer proteinlerin olduğunu söylemem pek şaşırtıcı bir bilgi olmasa gerek. Komşunuzda da benzerlerinden var. Herhangi bir hayvanat bahçesindeki filde ve su aygırında da benzerlerinden vardı, belki bağırsağınızdaki bakterilerde de var!

Peki konu evrim olduğunda sıkça duyduğumuz -ama okul kitaplarında ya da Wikipedia’da pek okuyamadığımız- bu proteinlerin benzerliği mefhumu neyin nesi? Bu amaçla önce yeni bir proteinin şeklini deneysel olarak çözmeyi özetleyecek, sonra da proteinler arası benzerlikleri arama problemine bakacağız. Bunları kullanarak da protein veri tabanındaki türler arası protein benzerliklerine bakarak kendi evrim ağacımızı kendimiz çizeceğiz.

Farklı DNAlar, Farklı Amino Asitler, Benzer Görevler...

Proteinler bir tür polimer, yani amino asit denilen küçük moleküllerin tren vagonları gibi art arda bağlanmasıyla oluşmuşlar. Evrimsel olarak yakın akraba türlerdeki proteinlerin bu amino asit dizileri arasında bir benzerlik mevcut. Yani trenleri vagon vagon kıyaslarsak bazı trenlerde pulman, yemekli ve yataklı vagonların benzer bir sırayla dizili olduğunu gözlemek gibi.

Fakat bu yaklaşım yeterli değil: eğer ortak evrimsel akrabadan günümüze geçen zaman yeterince uzunsa, bu süre boyunca mutasyonların birikmesiyle amino asit dizilimleri farklılaşabilir. Buna rağmen her iki canlı türündeki proteinler hala eski fonksiyonlarını sorunsuz sürdürüyor olabilirler. Proteinlerin biyokimyasal görevleri ile uzaysal şekilleri arasında bir bağlantı olduğundan, benzerlikleri avlamanın bir diğer yolu proteinlerin 3 boyutlu şekillerini kıyaslamak.

X-ışını Kristallografisi

Nanometre dünyasında yapı çözümlemenin lokomotifi, ışığın saçılımı. Ön camı kirliyken arabanızla giderken karşınıza bir anda güneş çıkıverirse cam parlar ve önünüzü göremezsiniz; çünkü güneş ışınları camdaki kir taneciklerinden her yöne saçılır. Benzer bir saçılım özelliği aslında küçük tanecikli nesneler için de geçerli: Arabanın camı da -etrafınızdaki diğer tüm nesneler gibi- atom ve moleküllerden oluştuğundan ışığı saçabilir. Eğer gelen ışığın dalga boyu uygun olsaydı, temiz camdan da her tarafa saçılım olurdu ve saçılan ışınların dağılımına bakarak da camın yapısal özellikleri hakkında çıkarımlarda bulunabilirdik. Hele de birbirinin kopyası moleküller bir kristal içerisinde periyodik bir şekilde yan yana dizilmiş olsalardı, her bir tanecikten saçılan ışık dalgaları birbirini bazı doğrultularda güçlendirebilir veya söndürebilirdi.

Bu saçılım deseni son derece değerli bilgi yüklü; ama fizik yasaları gereği, işe yarar bir desen elde edebilmemiz için kullanılan dalga boyunun en az tanecikler arası uzaklıklar kadar kısa olması gerekiyor. Atomik boyutlar nanometrenin onda biri kadar, bu sebeple de dalga boyu 500nm olan görünür ışık saçılım deneylerine hiç uygun değil. Dalga boyu çok kısa olan, yani çok yüksek enerjili, X-ışınları ise biçilmiş kaftan.

Enerji yoktan var edilemeyeceğine ve atomların boyutu da çok küçük olduğuna göre, her bir atoma gelen ve buradan saçılan X-ışını miktarı da oldukça sınırlı. Yani atomların fiziksel boyutlarının çok küçük olması sebebiyle her birinden gelen sinyalin şiddeti çok düşük; ama kullanılan kristaller boyut olarak toz şeker kristali kadar büyük. Bu kadar çok sayıda atomun katıldığı bir girişim sonucunda kontrastı yeterince yüksek bir saçılım deseni elde edilebiliyor (bunu ana görselde görebilirsiniz).

Farklı düzlemlerdeki atomlardan gelen ışınların birbirlerini güçlendirdikleri doğrultuları gösteren siyah beneklerin dağılımı rastgele değil, incelenen materyaldeki atomların dizilişi ile arasında deterministik bir ilişki mevcut. Değişik açılardan çekilmiş bunun gibi yüz kadar saçılım desenindeki beneklerin pozisyonlarını belirleyip biraz hesap yaparak moleküldeki atomların sayı, tür ve birbirine göre konumlarını bulmak mümkün. Yani bu çalışmanın nihai çıktısı, her atom türünün farklı bir renkteki bir top ile gösterildiği Şekil 2’deki gibi uzaysal bir obje. 

Protein Resimleri Albümü

O gün bu gündür yapısı çözülmüş proteinlere ait verilerin saklandığı Protein Veri Bankası'nın arşivinde bu yazı yazılırken 139.000 kayıt bulunuyordu. Bu kayıtların %90'ı 2000’li yılların ürünü ve her yıl da yaklaşık 10 bin tane daha ekleniyor.

Şeklini görmek istediğiniz proteini kütüphanede aramanız çoğu durumda yeterli. Araştırmacılardan bu düzeyde ilgi gören kristallografi, Nobel komitesinin de dikkatinden kaçmamış. X-ışınlarının kristallerden saçılımını bulan von Laue ve bu desenlerdeki düzeni yorumlayarak tuz kristallerini inceleyen Bragg’ler 1914-1915 Nobel Fizik ödüllerini aldılar. 1946 Nobel Kimya ödülünün sahibi Sumner’in enzim kristalleri üretilebileceğini göstermesi, proteinlerin yapısının bu yöntemle çözülebilmesi demekti ve nitekim kan proteini hemoglobin ve kas proteini miyoglobinin yapısını çözmeyi başaran Kendruw ve Perutz 1962 Nobel Kimya Ödülü'nü paylaştılar.

Türkiye Atlasta Nerede Yer Alır?

3 boyutlu geometrik şekilleri birbiriyle karşılaştırmak genel olarak zor bir problem. Daha kesin bir dille ifade edecek olursak cevabın doğru olup olmadığının sınamanın kolay bir yolu olsa bile, böyle bir adayı hızlı olarak bulabilecek bir algoritma henüz bulunamamış. Üstelik, böyle bir algoritmanın mümkün olmadığı düşünülüyor; ama bunun -ya da aksinin- matematiksel ispatı henüz yapılamadı. Ortalama bir proteinin art arda dizilmiş 350 kadar amino asitten oluştuğunu ve 20 amino asidin her biri farklı olsa da ortalama 15-20 atomdan oluştuğunu düşünürsek birkaç bin atomun oluşturduğu dev moleküllerle ilgileniyoruz demektir. Yani basit bir algoritma ile bütün olasılıkları tek tek deneyip olası en iyi cevabı aramak belki birkaç atomdan oluşan moleküller için mümkün olabilir, ama bu denli büyük sistemler için bilgisayarların işlem gücü yetmez. İşimizi bir şekilde kolaylaştırmalıyız.

Yöntemlerden birini anlatmak için daha somut bir soruyla ilinti kurayım: Türkiye, Kuzey Amerika’da mıdır? Bunu ilkokulda Afrika ile Güney Amerika kıyılarını eşleştirdiğimiz gibi çözebilirdik. Türkiye haritasını alıp aynı ölçekli Amerika haritasının üzerinde gezdirip her seferinde biraz kaydırarak biraz döndürerek, biraz da eğip bükerek kıtada oturduğu bir yer var mı diye bakabiliriz. Ama bu soruyu sabit noktalar arası uzaklıkları kıyaslayarak da çözebiliriz. Her iki haritadan da sabit noktalar seçelim ki bu amaçla uluslararası havaalanlarını kullanırsak Türkiye 35-40 nokta ile temsil edilir. Bu havaalanlarının arasındaki uzaklıkları ikili ikili hesaplıyoruz (Şekil 3a).

Eğer Türkiye Amerika’da ise, Amerika kıtasında öyle iki havaalanı olmalı ki, aralarındaki kuş uçuşu uzaklık Antalya–İzmir kadar olsun, çünkü Türkiye’nin bulunduğu kıtada İzmir (ADB) ve Antalya (AYT) havaalanları da bulunmak zorunda. Hayırsa önermemizin yanlış olduğu sonucunu çıkarıyoruz.

Yeryüzünde on binlerce havaalanı olduğundan, bazı havaalanı çiftleri tesadüfen eşleşebilir. Ama tabii bu kural diğer tüm havaalanı çiftleri için de geçerli olmalı: Türkiye’nin bulunduğu kıtada, ülkemizdeki her havaalanı çifti arası uzaklık kadar uzaklık bulunan en az bir çift havaalanı bulunmalı. Eğer bu incelemeyi yeterli sayıda havaalanı kullanarak yapar ve hala bir eşleşme bulursak, işte bu pek rastlantı ile açıklanamaz: burası olsa olsa Avrasya’dır. Nitekim Türkiye’nin uzaklık tablosunu (Şekil 3a), diğer tablolarla karşılaştırdığımızda, siyah dörtgenin benzerini Avrasya’da bulabilirken (Şekil 3b) Kuzey Amerika’da bulamıyoruz (Şekil 3c). Ve tabii bu dörtgeni havaalanlarının adlarını bilmeden de bulabilirdik.

Benzer Protein Parçalarını Aramak

Her ne kadar karışık gibi gözükse de, bilgisayarlara benzer şekil arama problemini bu ikinci yaklaşım yardımıyla çözdürmek daha kolay ve bu prensibi büyük molekülleri eşleştirmek için de kullanabiliriz. Atomik koordinatları bilinen bir proteindeki her bir amino asidi temsilen bir karbon atomu seçip tüm bu temsili karbon çiftleri arasındaki uzaklığı hızla hesaplayabiliriz. Sonra da bu 350x350’lik uzaklık tablosunun benzer parçalarını bilinen diğer tablolarda arayabiliriz. Üstelik yukarıdaki havaalanı analojisinde örtbas ettiğim sıralama problemi burada kendiliğinden ortadan kalkıyor: amino asitler proteinde art arda sıralanarak 1-boyutlu bir sistem oluşturduklarından tutarlı bir sıralama kuralı otomatik olarak var.

1993 yılında Heidelberg'de çalışan bilimciler Holm ve Sander tarafından geliştirilen bu yaklaşıma dayanan arama motoruna girdi olarak herhangi bir proteinin atom koordinatlarını veya buna erişebilmesi için gerekli bir “protein kayıt numarası” vermemiz gerekiyor. 1-2 dakikalık bir hesaplamanın ardından da veri tabanındaki benzerlerinin listesi önümüze geliyor.

Bu verilere kabaca bakarsak biz de teyit edebiliriz ki Kendrew, miyoglobin çalışmasında balina proteini (1MBN) kullanmış, çünkü balina miyoglobini kullanılmış yayınların sonuçlarına benzerliği %100. Bu balina miyoglobini, bağırsak bakterisine gen aktarımı yapılıp üretildiğinde de kayda değer bir değişiklik olmamış: Hala %99 benzer.

Listedeki evrimsel yakın akrabalarından bazıları: at (%87), yaban domuzu (%86), fil (%81), fok (%81), su kaplumbağası (%64), ton balığı (%43), deniz salyangozu (% 31), midye (% 19) ve yassı solucan (%18).

İnsan miyoglobini ise balinanınkine %86 benziyormuş, yani görünen o ki muhtemelen memeli bir hayvanmışız (Şekil 4). Üstelik miyoglobin dışında sitoglobin adında benzer başka bir proteinimiz daha varmış. Tabii bu çok basite indirgenmiş bir yorum, listelenen sonuçlar arasında bazı kısımları değiştirilmiş veya kesilmiş protein varyasyonları da çokça mevcut. 

İyi Olan Kazansın

Proteinlerin üretilmesine dair talimatlar DNA'da kodlu ve pek çok canlının genomu da çoktan dizilendi. Yani gerek elimizdeki bu genom verilerini kullanarak gerekse kütle spektroskopisi ile proteinlerin amino asit dizilimini bulabiliriz. Amino asit diziliminin bilinmesi ise her bir atomun diğer hangi atomlara bağlı olduğunu bilmemiz demek. Fakat atomların 3 boyutlu uzayda hangi koordinatlarda bulunduğunu sadece bu bağlantı şemasından çıkarmamız mümkün değil: açı ve uzaklıkları bilmiyoruz. Deneysel olarak ölçmek de her zaman kolay olmayabiliyor. Bunun önündeki engel bazı proteinlerin rekombinant teknolojilerle yüksek miktarlarda üretmekte karşılaşılan zorluklar veya çokça elde edilebildiği halde kristalleştirilememesi olabilir. Hatta başarısızlık ihtimali o kadar yüksek ki tek bir proteinin kamuya maliyeti tahminlere göre 100.000 ila 2.500.000 Amerikan doları arasındaymış.

Gelgelelim, çözülmüş protein şekilleri kütüphanesinin yeterince zengin olması ve günümüz süper-bilgisayarlarının inanılmaz işlem gücü sayesinde proteinlerin şeklini tahmin etmek mümkün. Daha açık bir anlatımla, yepyeni bir protein keşfetmiş olsaydınız ve sadece amino asit dizilimini çözebilmiş, ama şeklini bulmaya şartlar elvermemiş olsun. Girdisi bu amino asit dizilimi olan bir bilgisayar programı, bu yepyeni proteinin şeklini bir dereceye kadar tahmin edebilirdi. Çünkü yepyeni gibi gözükse de bu proteinin yapısı da diğerlerine benzer bir stratejiyle oluşturulmuş olacak. Gerek evrimsel akrabalarının konfigürasyonunu, gerekse atomlar arasındaki etkileşimleri göz önünde bulundurarak bir robot resim oluşturabiliriz.

Hatta bu amaçla iki yılda bir düzenlenen bir yarışma da var. Katılımcılara yapısı yeni çözülmüş -ama henüz halka açıklanmamış- birkaç proteinin sadece amino asit dizilimi veriliyor. Amaç, veri tabanları dolusu bilgiyi yorumlayan bir algoritma geliştirerek bu yeni proteinlerin yapısını doğru tahmin etmek. Tahmin edilen şekiller, deneysel olarak belirlenmiş şekille kıyaslanıyor ve kazanan da atom koordinatlarını en düşük yanılma ile tahmin eden grup oluyor. 2016 yılının başarılı tahminleri her 100 atomdan 90-95 tanesini 0.38 nm veya daha düşük bir hata payıyla yerleştirebilmiş.