Öğrenme ve Belleğin Moleküler Biyolojisi: Öğrenirken ve Öğrendiklerimizi Depolarken Beynimizde Neler Yaşanıyor?

Öğrenme ve bellek sinir sistemimizin en önemli özelliklerindendir. Öğrenme dünya ile ilgili bilgi edinme ve bellek edinilen bu bilginin kodlanma, depolanma ve daha sonra geri çağrılma süreçleridir. Bu süreçler olmaksızın sinir sistemimizin fonksiyonunun büyük ölçüde bozulacağı ve belleği etkileyen dramatik hastalıklardan görülebildiği gibi mental hayatımızın anlamsızlaşacağı açıktır. 

Geçtiğimiz 50 yılda uygun deneysel modellerin oluşturulması ve moleküler biyoloji alanındaki gelişmelerin sinirbilime uygulanması ile birlikte öğrenme ve bellek süreçlerinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında çok önemli ilerlemeler kaydedildi.

Bu yazı boyunca belleğin iki majör formundan biri olan implisit (prosedüral, non-deklaratif) belleğin kısa-, orta- ve uzun-dönem depolanmasına izin veren moleküler ve yapısal mekanizmalar üzerine odaklanacağız ve anlaşılır olmak amacıyla alanın erken döneminden günümüze uzanan önemli kilometre taşlarına değineceğiz. İmplisit bellek deney hayvanlarının bilinçli katılımını gerektirmediği için deneysel koşullarda çalışması daha kolaydır. Ancak, belleğin farklı tipleri, doğaları birbirinden çok farklı olmasına rağmen, aynı hücresel ve moleküler mekanizmalar ile depolanır.

Belleğin Kısa Tarihi

Brenda Milner’ın tarihi H.M. (Henry Molaison, ölümünden sonra ismi açıklandı) üzerindeki çalışmalarından belleğin bazı tiplerinin, en azından erken dönem depolanmalarının, hipokampus ve medial temporal lobu gerektirdiği anlaşıldı. Daha sonra belleğin eksplisit (deklaratif) ve implisit (non-deklaratif, prosedüral) olmak üzere en azından iki majör formunun olduğu ortaya çıktı. Gerçekler, olaylar, insanlar ve yerler gibi bilgiler deklaratif bellek ile işlenirken, algısal ve motor beceriler ve alışkanlıklar gibi süreçler implisit bellekte işlenir. Eksplisit bellek bilinci gerektiren ve esnek bir bellek tipiyken, implisit bellek bilinçsiz, otomatik ve bilginin nasıl kodlandığına katı bir şekilde bağlıdır.

Belleğin farklı tipleri olduğu bu erken dönem çalışmalardan biliniyor olmasına rağmen, nasıl oluştuğu ve nasıl depolandığı bilinmiyordu. Dahası, belleğin biyolojik temellerini araştırabilmek için henüz uygun bir model bile oluşturulmamıştı.

Belleğin depolanması üzerine ilk hücresel teori modern sinirbilimin babası olarak anılan Santiago Ramón y Cajal’ın olağanüstü gözlemlerine dayanmaktadır. Cajal, Golgi metodu ile boyanmış nöronlarda yaptığı çalışmaların sonucunda belleğin “sinir hücreleri arasındaki fonksiyonel bağlantıların” anatomik değişimi sonucunda ortaya çıktığı teorisini öne sürdü. Cajal zamanının çok ötesinde bir bilim insanıydı. Elinde yeterince kanıt olmamasına rağmen nöronların fonksiyonları hakkında doğru tahminlerde bulundu. İlginç olarak, Cajal’in fikirlerine şiddetle karşı çıkan bilim insanlarından biri, Cajal’in bu çalışmalarını mümkün kılan, anatomist Camillo Golgi’ydi. Cajal ve Golgi sinir sistemi üzerine bu çalışmalarından dolayı, aralarındaki görüş farklılıklarına rağmen, 1906 Nobel Fizyoloji veya Tıp ödülünü paylaştılar. Cajal’in “sinir hücreleri arasındaki fonksiyonel bağlantılar” olarak tanımladığı yapılar daha sonra büyük fizyolog Sir Charles Sherrington tarafından sinaps olarak ve teori Konorski tarafından “sinaptik plastisite” olarak adlandırıld. 

İmplisit Belleğin Depolanması

İmplisit belleğin moleküler mekanizmalarını anlamak için yürütülen çalışmalar öğrenmenin basit formlarına odaklandılar: Habituasyon, sensitizasyon, klasik koşullanma vs. Bu çalışmalar öğrenme ve bellek süreçlerinde modifiye edilen nöron devrelerini, kritik sinaptik bölgeleri ve daha sonra bu bölgelerdeki modifikasyonların moleküler temellerini belirlemeyi amaçladı.

Habituasyon

Nötral bir uyarının monoton olarak tekrarlanmasıyla uyarıyı görmezden gelmeyi öğrenme süreci olan habituasyon implisit öğrenmenin en basit şeklidir. Habituasyonun tarihi neredeyse insanlığın kendisi kadar eskidir ve ilk kez bir aslan gören bir tilkinin anlatıldığı Ezop (M.Ö. 4. yy’da yaşamış Yunan masalcı) masallarında bile rastlanabilir. Habituasyon üzerine ilk fizyolojik çalışma ise Sherrington’ın kedi ve köpeklerin spinal reflekslerinde yaptığı çalışmalardan gelmektedir. Sherrington, reflekslerin tekrarlı uyarılmasından sonra motor yolların cevabında bir azalma gözlemledi ve bu azalmanın reseptör adaptasyonu veya kas yorgunluğundan kaynaklanmadığını gösterdi. Ayrıca zayıf stimülasyonun, güçlü stimülasyona kıyasla daha hızlı habitüasyona yol açtığını gösterdi ve bunun paradoksal olduğunu belirtti (elbette ortada bir paradoks yoktu). Sir Charles Scott Sherrington “nöronların fonksiyonları üzerine katkılarından dolayı” 1932 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü ile ödüllendirildi. Habituasyon daha sonra hücresel seviyede Spencer ve Thompson tarafından incelendi ve habituasyon sırasında eksitatör internöronlardan motor nöronlar üzerine iletilen sinyallerin azaldığı gösterildi. Ancak, omurgalı canlıların sinir sistemi çok karmaşıktı ve daha fazla ilerlemenin yapılabilmesi için indirgemeci (reductionist) yaklaşımlara ihtiyaç vardı.

Bundan dolayı öğrenme ve bellek süreçlerinde çalışılabilecek uygun deneysel hayvanlar belirlemek için yoğun bir çalışma başlatıldı. Eric Richard Kandel dev deniz salyongozu Aplysia’nın uygun bir model olabileceğini düşündü. İnsan sinir sistemi 100 milyar nöron içerirken Aplysia 20,000 nöron ile basit bir sinir sistemine sahipti. Ayrıca nöronları memeli nöronlarına kıyasla çok daha büyüktü. Basit bir sinir sistemine karşılık bu canlının nöronal sistemleri habituasyon, dishabituasyon, sensitizasyon, klasik ve operant koşullanma gibi farklı öğrenme formları ile modifiye edilebilmektedir.

Wikimedia Commons

Aplysia solungacını ve atıkları ile deniz suyunu atmak için kullandığı sifon adında bir açıklığı geri çekmek için bir dizi defansif reflekse sahiptir. Bu refleksler omurgalı canlılarda daha önce çalışılan reflekslere benzer ve sifona yumuşak bir dokunuş hayvanın hem sifonunu hem de solungacını geri çekmesine sebep olur. Tekrarlı zararsız uyarılar bu refleksin habituasyonuna sebep olur ve aynı reflekste dishabituasyon, sensitizasyon ve klasik koşullanma ortaya çıkarılabilir.

Solungaç-geri çekme refleksinin nöral devresi detaylı olarak çalışılmıştır. Devre, sifonu innerve eden 24 mekanoreseptif duyusal nöron ve solungacı innerve eden 6 motor nöron arasındaki monosinaptik bağlantılardan oluşmaktadır. Ayrıca bir grup eksitatör ve inhibitör internöronlar aracılığıyla indirekt bağlantılar bulunmaktadır. Duyusal nöronlar uyarıldıklarında glutamat serbestlerler ve hem internöronlar hem de motor nöronlarda EPSP’ye (eksitatör postsinaptik akım) neden olurlar. EPSP’ler motor nöronlar üzerinde sumasyona uğrar ve solungacın geri çekilmesini sağlarlar. Eğer stimulus tekrarlanırsa duyusal nöronlardan kaynaklanarak, internöron ve motor nöronlarda üretilen EPSP azalır ve bunun sonucunda solungaç-geri çekme refleksinde habituasyon görülür.

Quantal analiz çalışmaları habituasyon sırasında presinaptik nörondan serbestlenen glutamat miktarının azaldığını göstermiştir. Habituasyon sırasında duyusal nöronun membranında kalsiyum kanalları inaktive olur ve Ca²⁺ akımının azalmasıyla nörotransmitter serbestlenme olasılığı da azalır. Sinaptik aktivitedeki değişikliğin kaynağı postsinaptik hücrenin nörotransmittere duyarlılığındaki değişiklik değildir. Sinaptik etkinlikteki bu azalma, aktive olan nöral yolun kendisinde meydana geldiği için homosinaptik depresyon olarak tanımlanır. Bu kısa-dönem değişiklik dakikalardan bir saate kadar sürer ve kısa-dönem habituasyon olarak adlandırılır.

Duyusal nörondan hem internöronlara hem de motor nöronlara nörotransmitter serbestlenmesinde azalma önemli bulguları da beraberinde getirir: solungaç-geri çekme refleksine dahil olan nöron grubu aynı zamanda belleğin depolandığı nöron grubudur. Bu bulgular bize belleğin depolanmasının özelleşmiş bir nöron tipi gerektirmediğini, refleks yolunun kendisinde depolanabileceğini ve bu yoldaki nöronların sinaptik plastisite kapasitesine bağlı olduğunu göstermektedir.

Aplysia’da 10 uyarılık tek bir oturum solungaç-geri çekme refleksinde kısa-dönem habituasyon ortaya çıkarırken, birkaç saatten bir güne kadar zamana yayılmış 4 oturum, 3 hafta kadar sürebilen uzun-dönem habituasyon ortaya çıkarır.

Uzun-dönem habituasyon indüklendikten sonra Aplysia'nın solungaç geri çekme refleksindeki değişim:

Kısa-dönemden uzun-döneme geçiş sürecine yapısal değişiklikler eşlik eder: (1) Önceden var olan sinapsların aktif bölgelerinin (presinaptik nöronda nörotransmitterlerin serbestlendiği bölgeler) sayısı, boyutu ve vezikül içeriğinin yeniden modellenmesi ve (2) sinaptik bağlantıların sayısında ve her bir nöronun sinaptik arborunun boyutunda değişiklikler ile kendini gösteren bir değişim süreci. Habituasyon sürecinde bir azalma görülürken, sensitizasyon sürecinde bir artış görülür.

Üstelik bu anatomik değişiklikler en az bir hafta değişmeden kalır ve üç haftadan önce tamamen ortadan kalkmaz. Bu anatomik çözünürlükteki değişikliklerin süresi davranışsal çözünürlükteki değişiklikler ile paralellik gösterir. Böylece morfolojik değişiklikler belleğin uzun-dönem depolanmasına katkı sağlar.

Tüm sinapslar aynı şekilde modifiye edilemezler. Bazıları tekrarlı aktiviteye karşı bile değişiklik göstermezken, özellikle öğrenme ile ilişkili nöral devreler hızla modifikasyona uğrarlar.

Sensitizasyon

Zararsız uyaranlar ile karşılaştığında nöral yollarının deprese olduğu habituasyonun aksine, hayvanlar zararlı bir uyaran ile karşılaştığında korkuyu öğrenir ve daha sonra zararsız olan uyaranlara bile karşı daha duyarlı hale gelir. Sonuç olarak Aplysia'da solungaç-geri çekme refleksi daha güçlü hale gelir ve bu süreç sensitizasyon olarak adlandırılır. Sensitizasyon terimi davranışsal boyutta refleksin güçlenmesini ifade eder. Nöral devre seviyesindeki güçlenme için fasilitasyon terimini kullanacağız.

Habituasyonda olduğu gibi geri çekme refleksinin sensitizasyonu da derecelidir: kuyruğa uygulanacak tek bir elektrik şoku dakikalar süren kısa-dönem bir sensitizasyona yol açarken, aralıklı uygulanmış 5 şok birkaç haftaya kadar süren uzun-dönem sensitizasyona yol açar. Kuyruğa uygulanan bir şok ayrıca daha önceden oluşturulan habituasyonun ortadan kalkmasına neden olur ve bu dishabituasyon olarak adlandırılır. 

Square Space

Aplysia’da sensitizasyona yol açan nöral devreler, habituasyonda rol alan aynı duyusal ve motor nöronlarda transmisyon artışını içerir. Ancak habituasyondan farklı olarak, fasilite edici uyarı kuyruk şoku ile aktive olan modülatör internöronlar aracılığıyla iletilir ve bundan dolayı habituasyona yol açan homosinaptik sürecin aksine, sensitizasyonda heterosinaptik bir süreç söz konusudur. Modülatör internöronların en önemlisi modülatör transmitter olarak serotonini kullanır.  

Serotonerjik nöronlar, duyusal nöronun presinaptik terminali dahil nöral devrenin birçok yerinde sinaps yapar. Kuyruk şoku sonrası serbestlenen serotonin duyusal nöronlarda G protein (Gs, stimülatör) kenetli reseptörüne bağlanır ve adenil siklaz enzimini aktive ederek cAMP oluşumunu artırır. Daha sonra, cAMP cAMP-bağımlı protein kinaz (PKA)’ı aktive eder. cAMP yokluğunda, PKA iki katalitik ve iki regülatör altüniteden oluşan katalitik aktivitesi çok düşük heterotetramerik bir protein kompleksidir. cAMP’nin regülatör altünitelere bağlanması, onların katalitik altünitelere affinitesini düşürür ve sonuç olarak katalitik etki aktive olur. Serotonin ayrıca G protein kenetli reseptörlerden Gq ailesine ait reseptörlerini aktive eder ve fosfolipaz C (PLC) enzimi aktive olur. PLC membran fosfolipidlerinin hidrolizi sonucu diaçilgliserol (DAG) üretimine yol açar ve DAG ise protein kinaz C (PKC)’yi aktive eder.

Biyoloji Defteri

PKA ve PKC en azından iki etki ile transmitter serbestlenmesini artırır: PKA iki farklı K⁺ kanalını fosforile ederek kapanmalarını sağlar. Bunlardan biri S-type K⁺ kanalı (serotonin sensitive) olarak adlandırılır ve memelilerdeki iki-por K⁺ kanalı ailesinin (K2P) karşılığıdır. S-type K⁺ kanalı istirahat membran potansiyelinde aktiftir ve kanalın kapanması hücrenin K⁺’a geçirgenliğini azaltarak membran potansiyelinin daha az negatif bir değere kaymasına neden olur, nöron aksiyon potansiyeli için eşik değerine yaklaşır; böylece nöronal eksitabilite artar. Bir diğeri ise gecikmiş dışa-doğrultucu akımlara aracılık eden bir K+ kanalıdır. Bu kanalın istirahat membran potansiyeline etkisi düşüktür ancak aksiyon potansiyelinin (AP) süresini uzatır ve hücre içine daha uzun süre Ca²⁺ akışı olmasını sağlayarak nörotransmitter serbestlenmesini artırır. PKC ise eksitabilite veya AP etkisinden bağımsız olarak transmitter içeren veziküllerin aktif bölgelere mobilizasyonunu artırır. PKC yolunun nörotransmitter serbestlenmesini artırmasına yol açan etkiler tam anlaşılamamıştır. Eksositoza aracılık eden proteinlerin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması sensitizasyon süreçlerinde PKC’nin rolünün aydınlatılmasını beraberinde getirecektir. Synaptotagminin (eksositoz için Ca²⁺ sensörü olarak görev yapar) PKC tarafından fosforilasyonunun kısa-dönem sensitizasyonda (STS) rolünün olduğu bilinmektedir.

cAMP ve PKA yolunun önemi duyusal nörona doğrudan cAMP’nin ve PKA’nın katalitik altünitesinin enjekte edildiği çalışmalardan anlaşılabilir.

Korkunun Klasik Koşullanması

Klasik koşullanma öğrenmenin daha karmaşık bir formudur. Tek bir uyarının özelliklerinin öğrenildiği habituasyon ve sensitizasyonun aksine, bu sefer hayvan bir uyarıyı diğeri ile ilişkilendirmeyi öğrenir. 

Klasik koşullanma ilk olarak Rus fizyolog Ivan Pavlov tarafından tanımlanmıştır. Ivan Petrovich Pavlov sindirim fizyolojisi üzerine katkılarından dolayı 1904 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü almıştır. Klasik koşullanmanın temeli iki uyarıyı birbirine eşlemeye dayanır. Koşullu uyaran (CS) belirli bir cevap uyandırmayacak ya da bazen uyaran ile ilgili olmayan zayıf bir cevap ortaya çıkaracak ışık, ses veya dokunma gibi bir uyaran seçilir. Koşulsuz uyaran (US) ise yiyecek veya şok gibi güçlü, tutarlı ve tahmin edilebilir bir cevap uyandıracak bir uyaran seçilir. CS’ın US tarafından takip edilerek tekrarlı olarak sunulmasıyla yeni ve farklı bir cevap ortaya çıkar: koşullu cevap. Böylece klasik koşullanma ortaya çıkarılmış olur.

Araştırmacılar Aplysia’da solungaç-geri çekme refleksinde klasik koşulanma oluşturmayı başardılar ve klasik koşullanmanın altında yatan moleküler mekanizmayı araştırmaya başladılar. Böylece daha önce Pavlov ve Thorndike tarafından ancak davranışsal boyutta çalışılabilen psikolojik modellerin, moleküler mekanizmaları nihayet aydınlatılabilecekti. Araştırmaların sonucunda, CS’ın US’dan hemen önce uygulandığı klasik koşullanma eğitiminin solungaç-geri çekme refleksini, sensitizasyona kıyasla daha fazla ve daha uzun süreli artırdığını buldular.

ArsTechnica

Aplysia solungaç-geri çekme refleksinde klasik koşullanma oluşturmak için CS olarak görev yapmak üzere sifona zayıf bir stimulus uygulanır, US olarak görev yapmak üzere ise kuyruğa güçlü bir şok uygulanır. Klasik koşullanma oluşturulduğunda sifona zayıf bir dokunuşa karşı bile solungaç-geri çekme refleksi güçlü bir şekilde ortaya çıkar. Klasik koşullanmanın oluşturulabilmesi için uyarılar arasındaki zaman aralığı ve uyarıların sıralaması kritiktir: efektif olması için CS US’dan önce gelmeli ve zaman aralığı sıklıkla 0,5 sn kadar olmalıdır.

Klasik koşullanmanın nöral temeli iki farklı stimulusun nöral temsilinin konverjans göstermesine dayanır. Daha önce tartışıldığı gibi, kuyruğa uygulanan güçlü bir şok, sifonu innerve eden duyusal nöronlar üzerinde sinaps yapan serotonerjik modülatör internöronları uyarır ve sonuçta sensitizasyon gelişir. Kuyruk şokundan hemen önce sifona hafif bir dokunuş uygulanması presinaptik fasilitasyonu daha fazla artırır ve bu süreç aktivite-bağımlı fasilitasyon olarak adlandırılır.

Aplysia’da klasik koşullanmanın moleküler temellerini araştıran çalışmalar aktivite-bağımlı fasilitasyonun kısmen sensitizasyonda görev alan aynı sinyalin, cAMP’nin artışından kısmen de postsinaptik nöronda meydana gelen değişikliklerden kaynaklandığını gösterdi.

Daha sonraki çalışmalar cAMP’deki artışın kaynağını araştırdı: Sifon üzerine uygulanan hafif bir dokunma, sifonu innerve eden duyusal nöronlarda bir AP ateşler ve voltaj-kapılı Ca²⁺ kanalları (VGCC) açılır. Bu duyusal nöronlardaki adenil siklaz enzimi Ca²⁺-Calmodulin’e duyarlı bir izoformdur. VGCC açılması ile birlikte hücre içine Ca²⁺ akışı olur ve Ca²⁺ calmoduline bağlanır. Calmodulin, Ca²⁺ bağlayıcı bir proteindir ve bağlanmayı takiben hücre içinde çok sayıda enzim ile etkileşerek onların aktivasyonunu sağlar. Daha sonra Ca²⁺-Calmodulin-duyarlı adenil siklaz enzimi aktive olur. Bu esnada kuyruğa uygulanan şok sonucu serotonerjik modülatör internöronlardan salgılanan serotonin reseptörüne bağlanır ve adenil siklaz enzimini aktive ederse, enzimin aktivasyonu çok daha güçlü gerçekleşir ve cAMP konsantrasyonu sensitizasyonda görülenden bile daha fazla olur.

Görülebileceği üzere olayların sıralamasının rolü burada kritiktir; olaylar arasındaki zaman farkı uzarsa veya sıralama tersine dönerse sinaptik aktivitede bir artış görülmez ve klasik koşullanma ortaya çıkmaz. Böylece klasik koşullanmanın altında yatan mekanizma sensitizasyona oldukça benzerdir ve adenil siklaz enziminin Ca²⁺ duyarlılığına bağlıdır. Bu yüzden adenil siklaz enzimi “tesadüf detektörü” (coincidence detector) olarak görev yapar.

Postsinaptik nöronda meydana gelen değişiklikler ise tetanik uyarılma esnasında hücre içine olan Ca²⁺ akımına bağlıdır ve bir başka sinaptik plastisite modeli olan long-term potentiation (LTP) mekanizmasına benzemektedir.

İmplisit Belleğin Uzun-Dönem Depolanması

Solungaç-geri çekme refleksi çalışmaları öğrenmenin bu basit formlarının bile farklı kısa ve uzun-dönem depolama evreleri olduğunu ortaya çıkardı: Bir kuyruk şoku STS’a yol açarken, aralıklı ve tekrarlı uygulamalar günlerden haftalara kadar uzun-dönem bellek oluşumuna yol açar. Bu farklı evreler davranışsal ve sinaptik çözünürlükte paralellik gösterir. 

Aplysia’da bu reflekse aracılık eden nöral devrelerin görece basitliği uzun-dönem belleğin moleküler temellerinin araştırılmasına izin verir. Bu glutamaterjik monosinaptik duyusal-motor nöron bağlantısı hücre kültüründe tekrar oluştulabilir. Bu in vitro modelde normalde kuyruk şoku ile modülatör internöronlardan serbestlenen serotoninin etkisi yine kısa serotonin uygulamalarıyla taklit edilebilir. Tek bir kısa serotonin uygulaması kısa-dönem fasilitasyona (STF) yol açarken, aralıklı ve tekrarlı uygulamalar bir haftadan uzun sürebilen uzun-dönem fasilitasyona (LTF) yol açar. Klasik koşullanma mekanizmasında olduğu gibi serotonin uygulamasından hemen önce duyusal nöronda bir AP ateşlenirse fasilitasyon daha güçlü ve daha uzun süreli olur. LTF Aplysia’da en iyi çalışılmış uzun-dönem bellek tipidir. LTF, STF gibi sinapslar arasındaki bağlantının güçlendirilmesini içerir ancak bu sefer yeni sinaptik bağlantıların oluşumu söz konusudur.

STF’un LTF’a dönüşme süreci konsolidasyon (sağlamlaştırma) olarak adlandırılır. Nasıl gerçekleştiğine dair ilk kanıt aslında omurgalı canlılar üzerinde yapılan çalışmalardan gelmektedir: uzun-dönem belleğin oluşması için protein sentezi gereklidir. 

Medical News Today

STS’da ele aldığımız gibi, duyusal nörona serotonin uygulanması cAMP’nin lokal artışına yol açar ve PKA’nın regülatör altünitelerinin katalitik altünitelerden ayrılmasını sağlayarak onu aktive eder ve katalitik altüniteler substratlarını fosforile ederek sinaptik etkinliği artırırlar. Serotonin uygulaması defalarca tekrarlandığında cAMP seviyelerinde sürekli bir artış görülür ve sinaptik transmisyon daha uzun süre ve daha güçlü olarak artar. Uzamış yüksek cAMP seviyesi, uzamış PKA etkinliğine yol açar. PKA, genel olarak hücresel büyüme süreçleriyle ilişkili olan p42 mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK)’ı da dolaylı bir yoldan sürece dahil eder ve ikisi de nükleusa hareket ederek uzun-dönem bellek için gerekli olan genleri aktive etmek üzere transkripsiyon faktörlerini fosforile ederler. PKA’nın MAPK yolunu aktive edici etkisi Aplysia nörotrofin (ApNT) adında memelilerdeki Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)'ün karşılığı olan bir nörotrofini serbestletici etkisine dayanır. ApNT daha sonra serbestlendiği aynı duyusal nöron üzerine etki ederek, başka bir deyiş ile otokrin bir etki ile hücre içinde etkilerini açığa çıkartır ve belleğin ortaya çıkmasını sağlayacak tüm sinyal yollarını güçlendirir.

Ayrıca, calcineurin gibi protein fosfatazlar, kinazların etkisine karşı çıkarak bellek oluşumunu inhibe ederek düzenlerler. Aktive edici ve baskılayıcı faktörlerin bir arada bulunması önemli bilgilerin depolanmasını sağlamak için evrimsel açıdan bir avantajdır.

Transkripsiyon Faktörlerinin Aktivasyonu

Nükleusta PKA, cAMP response element binding protein 1 (CREB-1)’i fosforile ederek onun transkripsiyon aktivatörü olarak fonksiyon görmesini sağlar. CREB-1, cAMP response element (CRE) adında bir promoter DNA sekansına bağlanır. CREB-1’ın bloke edilmesi selektif olarak LTF’u engellerken STF’u etkilemez. CREB-1’in fosforilasyonu onun CREB-binding protein (CBP) adında bir koaktivatöre affinitesini artırır. CBP’in iki bölgesi vardır: Biri fosforile CREB’e bağlanır ve diğeri bazal transkripsiyon makinesini aktive eder. Ayrıca CBP’nin intrinsik histon asetilaz (HAT) aktivitesi vardır. Böylece PKA CREB-1 aracılığıyla gen ekspresyonunu artırır.

Aplysia duyusal nöronlarında Aplysia CREB-1 (ApCREB-1)’in aktivitesi ile bellek ile ilişkili bazı genlerin ekspresyonu artar. Bunlardan erken dönemde gerçekleşen ikisi ubiquitin karboksiterminal hidrolaz enzimini ve bir transkripsiyon faktörü olan CCAAT-box enhancer binding protein (C/EBP)’i kodlayan genlerdir. C/EBP yeni sinaptik bağlantıların oluşması için gerekli ikinci bir gen ekspresyonu dalgasını aktive eder. C/EBP’nin bloke edilmesi STF’u etkilemeksizin LTF’u engeller.

Ubiquitin hidrolaz PKA’nın regülatör altünitelerinin ubiquitin-aracılı yıkımını sağlar. Böylece katalitik altüniteler serbest kalır ve cAMP seviyesi normalde döndükten sonra bile eksitabiliteyi, transmitter serbestlenmesini ve sinaptik etkinliği güçlendirmek için gerekli olan CREB-1 gibi proteinleri fosforile etmeye devam edebilir. Tekrarlı serotonin (kuyruk şoku sonrası veya doğrudan) uygulamaları sonucu katalitik altünite 24 saate kadar başka bir uyarı olmaksızın aktif kalabilir. Böylece bir uzun-dönem bellek elde edilmiş olur ve bu bilinen en basit uzun-dönem bellek formudur!

The New Yorker

Uzun-dönem sinaptik değişikliklerin başlatılması sadece bellek oluşumunu teşvik eden CREB-1 gibi transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenmez aynı zamanda bellek oluşumunu baskılayan faktörlerin aktivitesi ile düzenlenir. CREB-2, CREB-1-aracılı transkripsiyonu baskılar ve CREB-2’nin etkisinin bloke edilmesi, normalde STF oluşturan tek oturumluk bir serotonin uygulamasının 24 saate kadar devam eden yeni sinaptik bağlantıların oluştuğu bir LTF ortaya çıkarmasına neden olur. CREB-2’nin MAPK tarafından fosforile edilmesi onun inhibitör etkisini ortadan kaldırır. Böylece LTF’nin oluşması hem ApCREB-1’in PKA tarafından hem de ApCREB-2’nin MAPK tarafından fosforilasyonunu gerektirir.

CREB-1 tarafından aktive edilen diğer gen C/EBP transkripsiyon faktörünü kodlar. C/EBP hem homodimer hem de activating factor (AF) adında bir diğer transkripsiyon faktörüyle heterodimer oluşturarak hedef gen bölgelerine bağlanırlar ve yeni sinaptik bağlantıların oluşması için önemli olan genlerin ekspresyonunu artırırlar.

LTF sürecinde duyu ve motor nöron arasındaki sinaptik bağlantıların sayısı iki katına kadar çıkabilir. Aksine LTH’da hücreler sinaptik bağlantılarını geri çekerler. Böylece uzun-dönem modifikasyonlarda çift-yönlü yapısal bir yeniden düzenlenme görülür. Sinapsların yeniden modellenmesi karmaşık bir süreçtir ve hakkında bilinenler daha sınırlıdır. Sinaptik plastisitenin yapısal düzenlenmesini ayrı bir başlık altında ele alacağız.

Belleğin Epigenetik Mekanizmaları

Yürütülen çalışmalar DNA sekansından bağımsız olarak gen ekspresyonunu değiştiren epigenetik mekanizmaların uzun-dönem bellek oluşumunu etkilediğini ortaya çıkarmıştır. Guan ve meslektaşları çalışmalarında eksitatör ve inhibitör nörotransmitterlerin kromatin yapısını nasıl değiştirdiğini ortaya çıkardı. Eksitatör serotoninin CREB-1 ve CBP ile HAT aktivitesini, inhibitör FMRFamide’in ise CREB-2’yi dahil edip histon deasetilaz (HDAC) aktivitesini artırarak kromatini yeniden modellediğini ve böylece transkripsiyon faktörlerinin hedef gen bölgelerine ulaşabilirliğini düzenlediklerini gösterdiler.

Kromatinin temel yapı taşı olan nükleozom DNA’nın histon proteinleri etrafına sarılması ile oluşmuştur. Histon proteinleri oldukça pozitif yüklü olmasını sağlayan aminoasit bölgeleri içerir. Bu pozitif yükler, histon proteinlerinin, negatif yüklü DNA ile elektrostatik etkileşimler aracılığıyla sıkıca bağlanmasını sağlayabilir. Ancak histon proteinlerinin bu pozitif yükleri asetilasyon yoluyla nötralize edilebilir ve DNA ile etkileşimi gevşetilebilir böylece transkripsiyon faktörlerinin ve bazal transkripsiyon makinesinin DNA’ya bağlanması kolaylaştırılır, HDAC enzimatik aktivitesi ise bu süreçleri tersine çevirerek transkripsiyonu inhibe eder.

Science

Epigenetik değişiklikler kromatin yapısındaki değişiklikler ile sınırlı değildir. Bir diğer önemli transkripsiyon regülatörü protein kodlamayan küçük RNA’lardır. Aplysia’da nöronlar için spesifik, en çok bulunan microRNA miR-124’tür. miR-124 duyusal nöronlarda bulunur ve CREB-1’in mRNA’sına bağlanarak onu inhibe eder. miR-124 dahil birkaç miRNA serotoninin etkisi ile down-regüle olur böylece CREB-1’in translasyonu disinhibe olur. Aplysia nöronları ayrıca piRNA olarak adlandırılan bir diğer protein kodlamayan RNA tipi içerir. Bu moleküllerden biri olan piRNA-F serotonine cevap olarak artar. piRNA-F, CREB-2’nin promoterindeki CpG adalarını serotonin-bağımlı bir tarzda metile eder ve böylece uzun-dönem belleğin majör inhibitör genini susturur. Böylece serotonin hem piRNA-F hem de miRNA-124’ün regülasyonunu sağlar: piRNA-F’in artmasına yol açar ve CREB-2’yi susturur, miR-124’ün azalmasına yol açar ve CREB-1’in translasyonunu artırır. Her iki etki de bellek konsolidasyonunu sağlar ve uzun-dönem depolanmaya izin verir.

Sinaptik Etiketleme ve Yakalama Hipotezi

Uzun-dönem belleğin kısa-dönemden en temel farklarından biri uzun-dönem belleğin gen ekspresyonunu gerektirmesidir. Nükleusun bu sürece dahil olması uzun-dönem bellek sırasında gerçekleşen değişikliklerin hücre boyunca etki göstereceği fikrini akla getirebilir. Ancak, örneğin tipik bir memeli nöronunun 10,000 kadar hedef hücre ile sinaps yapıyor olması tüm sinapsların güçlendirilmesinin gerekli olmadığını gösterir. Bu yüzden bir nöronun farklı sinapslarının birbirinden bağımsız olarak modifiye edilebilmesi gereklidir. Bireysel sinapsların uzun-dönem bellek için bağımsız birimler olup olmadığını araştırmak için Martin ve meslektaşları bir duyusal nöronun iki kola ayrılan aksonunun iki motor nöronu innerve ettiği bir hücre kültür düzeneği hazırladı. Duyusal nöronun presinaptik terminallerinden biri tek oturumluk bir serotonin uygulamasıyla uyarıldığında o sinapsta STF ortaya çıkarken, uygulamanın yapılmadığı sinapsta bir değişiklik olmadı. 5 oturumluk bir serotonin uygulaması yapıldığında ise yeni sinaptik bağlantıların oluştuğu, 24 saatten uzun süren LTF ortaya çıkarken uygulamanın yapılmadığı nöronda yine bir değişiklik olmadı. Böylece hem STF hem de LTF'un sinaps spesifik olduğu anlaşıldı. Martin ve meslektaşları daha sonra bu spesifitenin nasıl sağlandığını araştırmaya başladılar ve iki olasılığı değerlendirdiler: (1) Gen ekspresyon ürünleri hücre boyunca tüm sinapslara teslim edildiğini ancak sadece sinaptik aktivitenin gerçekleştiği yani “etiketlenen” sinapslarda kullanılabilir olduğunu ve (2) transkripsiyon ürünlerinin selektif olarak sinapslara gönderildiğini.

Aynı düzenekte tekrar bir sinapsa 5 oturumluk bir serotonin uygulaması yaptılar ancak bu kez diğer sinapsa eş zamanlı olarak tek bir oturumluk serotonin uyguladılar. Normalde STF ortaya çıkaran tek oturumluk serotonin uygulaması bu şartlar altında LTF’a yol açtı. Böylece tek bir dönemlik serotonin uygulaması o sinapsta nükleer ürünlerin kullanılabilmesini sağladı. Aplysia’da ve kemirgen hipokampüslerinde yürütülen birbirinden bağımsız çalışmalar gen ürünlerinin tüm sinapslara teslim edildiğini ancak sadece serotonin tarafından uyarılan sinapslarda kullanılabildiğini söyleyen sinaptik etiketleme ve yakalama (synaptic tagging and capture) hipotezinin ortaya çıkmasını sağladı. Sinaptik etiketleme ve yakalama hipotezi bize plastisitenin, nöronun kendi aktivite geçmişinden etkilendiğini, yani başka bir deyiş ile plastisitenin de plastisitesi olduğunu (metaplastisite) göstermektedir.

Wired

Martin sinaptik etiketleme ve yakalama hipotezinin doğasını açıklamak için çeşitli lokal inhibitörler uygulayarak iki farklı komponent belirledi. Lokal olarak PKA inhibitörü uyguladığında serotonin ile etiketlenmiş sinapslar artık gen ürünlerini kullanamıyordu ve bu PKA’nın uzun-dönem sinaptik plastisite sürecinin başlaması için gerekli olduğunu gösteriyordu.

Asıl çarpıcı bulgu ise Martin aynı şartlar altında protein sentezi inhibitörü emetin kullandığında ortaya çıktı. Sinapsa lokal emetin uygulamasında sinaptik capture gerçekleşiyor ve LTF ortaya çıkıyordu. Ancak 24 saatten sonra bu değişiklikler korunamıyordu. Bu da gösteriyordu ki LTF’un stabilize edilmesi ve korunması hücre gövdesinde (somatik) gerçekleşen protein sentezine ek olarak lokal protein sentezinin de gerçekleşmesi gerekiyordu.

Özetle bu bulgular Aplysia’da sinaptik etiketlemenin iki farklı komponentini göstermektedir. İlk komponent 24 saat sürmektedir ve LTF’u başlatır, PKA aktivitesine bağlıdır ve lokal protein sentezini gerektirmez. İkinci komponent ise 72 saate kadar olan dönemi kapsar ve LTF’un stabilize edilmesini ve korunmasını sağlar. Bu süreç lokal protein sentezine bağlıdır. Lokal protein sentezinin nasıl düzenlendiğini araştıran çalışmalar sinirbilimde heyecan verici gelişmeleri de beraberinde getirdi. Şimdi dikkatimizi bu büyük gelişmelere çeviriyoruz.

Uzun-Dönem Belleğin Korunması: Prion-Benzeri Proteinlerin Rolü

Belleğin korunması ve sinapsların yapısal değişikliklerinin sağlanabilmesi için lokal protein sentezinin gerekli olması ve somadan gelen gen ürünlerinin serotonin ile uyarılmayan sinapslarda kullanılamıyor oluşu uyarılmamış sinapslarda bu ürünlerin kullanılması için gereken proteinlerin serotonin uyarısına cevap olarak sinapsta lokal olarak üretildiğini düşündürür. mRNA’lar somada yapılıp tüm sinapslara taşındığı ve sadece serotonin ile uyarılmış olanlarda kullanılabildiği için Si ve meslektaşları bu mRNA’ların başlangıçta sessiz olduğunu ve uyarılmış sinapslarda bir şekilde aktive edildiğini düşündüler ve protein sentezi için bir regülatör aramaya başladılar.

Joel Richter, Xenopus oositlerinde maternal RNA’nın sitoplazmik poliadenilasyon element bağlayıcı protein (CPEB) tarafından aktive edilene kadar sessiz olduğunu daha önce göstermişti. Böylece Aplysia’da CPEB için bir homolog arayışı başladı. Bu arayışın sonunda Si ve meslektaşları Aplysia’da Richter tarafından tanımlanan gelişimsel izoforma ek olarak farklı özelliklere sahip yeni bir izoform (ApCPEB) tanımladı. Bu izoformun bloke edilmesi LTF’un başlamasını değil ancak korunmasını engelledi. ApCPEB’i dikkat çekici kılan N terminusunun, iyi karakterize edilmiş maya prion proteinlerine benziyor olmasıydı.

Prion adlandırması “proteinaceous infectious agents”dan gelmektedir ve Stanley Prusiner tarafından nörodejeneratif hastalıkları çalıştığı sırada tanımlanmıştır. Prusiner, prion proteinini (PrP) normal hücresel proteinlerin, amiloidojenik, kendi kendisini sürdürebilen formları olarak tanımlamıştır. Stanley B. Prusiner Prion keşfi üzerine 1997 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü almıştır.

Prionlar en azından iki formda bulunur: inaktif monomerik ve aktif agrege. Patolojik prionların monomerik formdan agrege forma geçişi spontane olarak gerçekleşir ve bu “kendi kendini sürdürebilen” formda hücrelerin ölümüne yol açar. Bugün prionların birçok nörodejeneratif hastalığın temelinde yattığı düşünülmektedir. Tüm prionlar hastalığa sebep olmaz, aksine fizyolojik fonksiyonlara sahip olabilirler.

The New York Times

Bu fizyolojik prionlar patojenik olanlardan iki yönüyle ayrılır: (1) monomerik durumdan agrege duruma geçişleri fizyolojik bir sinyal ile düzenlenir ve (2) agrege formun fizyolojik bir fonksiyonu vardır.

Sinaptik etiketleme hipotezinde sinaps-spesifik protein sentezini düzenlemekte ApCPEB’in üç fonksiyonu onu akla yatkın bir aday haline getirdi: (1) serotonine cevap olarak ApCPEB miktarı sadece uyarılan sinapsta artar, (2) ApCPEB sinaptik plastisite için gerekli hedef mRNA’ların translasyonunu düzenler ve (3) daha önce belirtildiği gibi, ApCPEB bloke edilmesi LTF’un başlangıcını değil ancak korunmasını engeller (LTF’un başlangıç evresinde PKA’nın rolünü hatırlayınız). LTF’un indüklendiği sinapslarda bile ApCPEB’in bloke edilmesi LTF’un sürdürülebilirliğini engeller. Bu sonuçlar LTF’un sürdürülebilmesinin ApCPEB-bağımlı protein sentezine bağlı olduğunu göstermektedir. 

ApCPEB’in prion-benzeri yapısı belleğin sürdürülmesi için gerekli protein sentezine izin verir. Protein sekans araştırmaları ApCPEB’in homologlarının Drosophila, fare ve insanda da bulunduğunu göstermiştir. ApCPEB iki farklı konformasyonel durumda bulunabilir. Bunlardan biri monomerik ve kendi kendini sürdürme becerisinden yoksun olduğu durum ve diğeri belirli bir değeri aştıktan sonra agrege olarak aktif hale geçen ve sessiz mRNA’ların aktive edilmesine, böylece belleğin sürdürülmesine izin veren aktif form.

ApCPEB Aplysia nöronlarında aşırı eksprese edildiğinde amiloid benzeri benekli yapılar oluşturur. Bu benekli yapılar ApCPEB proteinlerinin agrege olmasından kaynaklanır ve bir kez agrege, aktif, multimerik form oluştuğunda yeni sentezlenmiş monomerik ApCPEB’leri de kendi yapılarına dahil ederler. Üstelik serotonin uygulaması bu benekli yapılarda artışa yol açar ve ApCPEB’nin sinaptik aktiviteye göre regüle edilmesine izin verir.

CPEB Regülasyonunda microRNA-22’nin Rolü

Serotonin hangi mekanizma ile CPEB upregülasyonunu ve daha sonra multimerik aktif forma geçişini sağlamaktadır? Bu soruyu cevaplayacak tam bir model olmasa bile bilinen bazı önemli komponentler vardır ve microRNA-22 (miR-22) merkezi bir role sahiptir. miR-22 Aplysia duyusal nöronlarında ekprese edilir ve serotonine cevap olarak down-regüle olur. miR-22’nin down-regülasyonu CPEB seviyelerinde artışa yol açar. miR-22’nin inhibe edilmesi aynı etkileri taklit eder ve LTF’u güçlendirir, aksine miR-22’nin aşırı eksprese edilmesi CPEB down-regülasyonuna yol açarak LTF’u zayıflatır.

miR-22 aşırı ekspresyonu ayrıca, dolaylı olarak, atipik PKC ailesinin bir üyesi PKMζ'nın presinaptik downregülasyonuna yol açar. PKMζ, mRNA’sının 3’UTR (untranslated region)’ı sitoplazmik poliadenilasyon element (CPE) bölgesi içerir. Büyük olasılıkla bu sebep ile, miR-22 artışı ile CPEB downregülasyonuna, mRNA’sı CPE içeren PKMζ'nın down-regülasyonu da eşlik eder. PKMζ'nın hem presinaptik hem de postsinaptik olarak LTF’da rolü vardır. Böylece serotonin ile miR-22’nin presinaptik downregülasyonu, CPEB ve CPEB’in PKMζ dahil hedeflerinin upregülasyonuna yol açar.

Tekrar özetle, ApCPEB en azından iki konformasyonel durumda bulunur: (1) inaktif veya baskılayıcı monomerik durum ve (2) kendi kendisini sürdüren, aktif multimerik durum. Uyarılmamış sinapsta ApCPEB’in bazal seviyeleri düşüktür ve protein monomerik yapıdadır. Serotonine cevap olarak miR-22’de azalmaya bağlı ApCPEB artışı, ApCPEB’in monomerik yapısından multimerik prion-benzeri aktif yapıya geçişini sağlar. Aktif yapı bir sinapsta bir kez oluştuktan sonra somada üretilen ve tüm sinapslara dağıtılan sessiz mRNA’lar ApCPEB’in o sinapsta sınırlı, lokal etkisiyle aktifleştirilebilir.

Somadan gelen mRNA’ların bazıları ApCPEB’i kodlar. Aktifleşmiş multimerik ApCPEB yeni sentezlenen monomerik ApCPEB’leri de kendisine dahil edebilir ve böylece ApCPEB kendi kendisini sürdürebilir. Bu mekanizma öğrenme ile ilişkili sinaptik modifikasyonları ve uzun-dönem, sinaps spesifik moleküler değişiklikleri mümkün kılar ve bellek depolanmasının sürdürülmesini sağlar. 

Edutopia

Fizyolojik mekanizmalar sadece CPEB’nin aktif forma geçişini sağlıyor olsaydı, üstelik bu kendi kendisini güçlendirebilen bir mekanizmayken, kontrolü büyük ölçüde zorlaşmış olurdu. Si ve meslektaşları, heat shock protein (HSP) 104’ün, ApCPEB’in multimerik formdan tekrar monomerik forma geçişini sağladığını gösterdi. Ayrıca aktif CPEB bulunduğu sinapstan hücrenin diğer bölgelerine diffüze olabilseydi hücre boyunca mRNA’ları aktive eder ve monomerik CPEB’leri de multimerik yapıya dahil ederdi. Bu tüm sinapsların güçlendirilmesine yol açardı. Bu yüzden ApCPEB’in etkisini aktifleştirildiği sinapsta kısıtlayacak güvenlik faktörleri olmak zorundadır. Multimerik ApCPEB’in burada bir diffüzyon bariyeri oluşturuyor olması bir mekanizma sağlayabilir veya aktin sitoskeletonu gibi hücresel komponentler ile etkileşimler lokalizasyona katkıda bulunabilir. ApCPEB’in aktive ettiği sessiz mRNA’ların kodladığı proteinlerden biri aktindir.

Son olarak CPEB’in sessiz mRNA’ları nasıl olgun, translasyona hazır mRNA’lara dönüştürdüğünü kısaca ele alacağız. Poliadenilasyon olgun mRNA oluşumu için gerekli bir basamaktır. Sessiz mRNA’lar sitoplazmik poliadenilasyon element adında bir sekans içerirler. CPEB bu sekansa bağlanır ve poliadenilat polimeraz (PAP) enzimi aracılığıyla sessiz mRNA’lara poli-adenin kuyruğu ekleyerek onların olgun mRNA’lara dönüşmesini sağla.

Sinaptik Plastisitenin Yapısal Komponentleri

Belleğe aracılık eden yapısal değişiklikler en yoğun olarak solungaç-geri çekme refleksinin sensitizasyonunda çalışılmıştır. 1995 yılında kısa-dönem bellekten uzun-dönem belleğe geçiş sürecinde orta-dönem bellek adında ayrı bir geçiş fazı tanımlanmıştır. Bu faz protein sentezini gerektirir ancak transkripsiyondan bağımsızdır.

Bellek konsolidasyonuna yani kısa-dönemden uzun-dönem belleğe geçiş sürecine iki sınıf yapısal değişiklik eşlik eder: (1) zaten var olan presinaptik bölgelerde aktif bölgelerin sayısında, büyüklüğünde ve vezikül içeriğinde artışı içeren bir yeniden modellenme ve (2) sinaptik varikozitelerin sayısında iki kat artışa yol açan daha geniş bir büyüme süreci. Araştırmalar deney hayvanlarında daha önceden var olan varikozitelerin bir kısmının aslında sinaptik transmisyon için yetkin olmadığını ve aktif bölge içermediğini, yani aslında sessiz sinapslar olduklarını göstermiştir.

Aplysia’da davranışsal ve morfolojik değişikliklerin karşılaştırıldığı çalışmalar LTF’da görülen sinaptik bağlantı sayısındaki artışın zamanla tersine dönmesiyle (1 hafta boyunca değişmeden kalır ve 3 haftanın sonunda kısmen eski haline döner) sensitizasyonun da ortadan kalktığını göstermiştir. Davranışsal ve yapısal değişikliklerin birbirine paralel olması uzun-dönem bellek depolanmasının, en azından kısmen, bu yapısal değişiklikler sayesinde başarıldığını düşündürür. 

Uzun-dönem habituasyonda ise tam tersine, aktif bölgelerin sayısında, büyüklüğünde ve vezikül içeriğinde bir azalış görülür ve toplam sinaps sayısı azalır. LTH fosfatazların dahil olduğu karmaşık bir süreçtir ve öğrenmenin daha basit bir formu olarak görülmesine rağmen daha az anlaşılabilmiştir.

Böylece sinaptik bağlantılar iki yönlü de tekrar düzenlenebilir. Bu bulgular Cajal’ın ileri görüşlü fikirlerine doğrudan kanıt sağlar.

The Daily Beast

LTF Sırasında Sessiz Sinapsların Aktivasyonu

Çeşitli markerların kullanıldığı çalışmalar LTF’un zaman bağımlı farklı fazları sırasında meydana gelen değişiklikleri ortaya çıkarmıştır. Değişiklikleri gözlemlemek için; tüm hücre markeri Alexa-594, sinaptik vezikül dağılımını gözlemlemek için synaptophysin-eGFP ve aktif transmitter serbestleme bölgelerini gözlemlemek için synapto-PHluorin (synPH) kullanıldı. SynPH, synaptobrevin (VAMP, eksositoz sürecinde önemli bir protein) proteininin lüminal tarafına bağlanır. Vezikülün asidik ortamında bu protein non-floresan özellikteyken, vezikül serbest bırakıldığında ekstrasellüler sıvı ortamında floresan özellik kazanır ve sinaptik aktivite hakkında bilgi edinebilmemizi sağlar.

Aplysia duyu-motor nöron kültürlerinde başlangıçta, Alexa-594 ile işaretli presinaptik varikozitelerin %12’sinin synPH ve synaptophysin-eGFP ile etiketlenmediği ve bu yüzden transmitter serbestleme becerisinden yoksun sessiz sinapslar olduğu ortaya çıktı. Tekrarlı serotonin uygulamaları bu sessiz sinapsların hızla aktive olmasına ve sinaptik iletim için gerekli olan nörotransmitter içeren veziküller ve aktif bölge materyali ile dolmasına yol açtı. Serotonin uygulamasını takiben bu orta-dönem bellek depolanmasına yol açan süreç 30 dakika içinde başlar ve 3-6 saat içinde tamamlanır. 24 saat anında yeni aktive olmuş sinapsların %32’sinden sessiz sinapsların aktive olması sorumludur. Böylece sessiz presinaptik varikozitelerin hızlı aktivasyonu sensitizasyon sürecinin kısa ve uzun-dönem arasındaki geçiş fazına, orta-dönem belleğe yol açar.

LTF Sırasında Yeni Fonksiyonel Sinapsların Oluşumu

Yeni varikozite oluşumu LTF’un daha yavaş gelişen ve daha güçlü fazını oluşturur. Yeni varikozite oluşumu 5 oturumluk serotonin uygulamasından sonra 12-18 saat içinde oluşmaya başlar ve 24 saat anında yeni aktive olmuş sinapsların %68’inden sorumludur.

Serotonin uygulamasıyla LTF’un indüklenmesinin başlangıcında, daha önce belirtildiği gibi, mevcut sinapsların içeriklerinde ve aktif bölgelerinin büyüklüklerinde genel bir artış meydana gelmektedir. Bu presinaptik büyümeyi sinapsların belirgin bir bölünme süreci izler, böylece toplam sinaps sayısında artış görülür.

LTF’da Yapısal Değişikliklerin Moleküler Mekanizmaları

Spontane Transmitter Serbestlenmesi

Yeni sinaptik bağlantıların oluşumu hem presinaptik hem de postsinaptik hücrenin katılımını gerektirir. Aplysia’da LTF indüklenmesiyle artan PKA aktivitesi veya doğrudan PKA uygulaması presinaptik duyusal nörondan spontane transmitter serbestlenmesinde artışa yol açar. Bu artış post-sinaptik nöronun sürece dahil edilmesi ve mevcut sinapsın yeniden modellenmesi için kritik bir trans-sinaptik sinyal sağlar. Artan glutamat serbestlenmesi mGluR5 reseptörlerini aktive eder ve IP₃ üretimine yol açar böylece intrasellüler depolardan Ca²⁺ serbestlenir bu da AMPA reseptörlerinin membrana yerleştirilmesini sağlayarak postsinaptik nöronun aynı miktarda glutamata dahi daha güçlü cevap vermesine neden olur. 

Aeon

Sinaptik Plastisitede Hücre Adhezyon Molekülleri

Aplysia hücre adhezyon molekülü (ApCAM)’nün transmembran izoformunun, serotonin ile indüklenen clathrin-aracılı endositozunun sinaptik büyüme ve LTF’un gerçekleşmesi için izin verici basamak olduğu düşünülür. Bu adhesive bağlantılar normalde sinaptik büyümeyi inhibe eder. ApCAM’ın transmembran izoformunun yanı sıra birde GPI-linked izoformu bulunmaktadır. Bu izoformun duyu-motor nöron sinaptik bağlantı noktasında daha yüksek oranda bulunduğu bilinmektedir. Bu bilgilerin ışığında ortaya bir model çıkarılmıştır: Serotoninin ApCAM’ın transmembran izoformunun clathrin-aracılı endositozunu başlattığı ve onu membrandan uzaklaştırarak normalde sinaptik büyümeyi inhibe edici etkisini ortadan kaldırdığı düşünülü. GPI-linked izoform ise endositoza uğramaz ve daha önceden kurulmuş olan sinaptik bağlantılar bütün olarak kalır.

Sinapstan Nükleusa Sinyal İletimi

Yazı boyunca daha önce PKA ve MAPK’ın nükleusa transloke olarak transkripsiyon faktörlerini fosforile ettiklerini ve uzun-dönem bellek için gerekli olan genlerin transkripsiyonunu artırdıklarını belirtmiştik. Daha yakın dönemde yapılan çalışmalar PKA’nın, ApCAM ile membrana bağlı tutulan bir transkripsiyon regülatörü olan CAM-ilişkili protein (CAMAP)’i fosforile ettiğini göstermiştir. CAMAP’ın fosforilasyonu onun ApCAM’dan ayrılmasına sağlar ve daha sonra ApCAM’ın clathrin-aracılı endositozu gerçekleşir. CAMAP sinapstan nükleusa transloke olur CREB-1 ve C/EBP transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna katkı sağlar. CAMAP ayrıca miR-124’ün CREB-1 üzerindeki inhibisyonunu ortadan kaldırır ve piRNA-F’in aktivasyonuna yol açarak ve daha sonra CREB-2 promoterini metile ederek susturur. Tüm bu etkiler LTF’u teşvik eder.

LTF Sırasında Yeni Oluşan Sinapsların Stabilizasyonu

LTF’un başlaması ve yeni sinaptik bağlantıların oluşumuna yol açan mekanizmalar daha sonra korunmasını sağlayan mekanizmalardan farklıdır. Serotonin uygulamasından 24 saat sonrasına kadar olan sinaptik fonksiyondaki artış ve sinaptik büyüme nükleer transkripsiyon ve somatik translasyonu gerektirir. Bu değişikliklerin sürdürülmesi ise ek olarak lokal protein sentezini gerektirir.

LTF’da lokal protein sentezinin rolünü ve zaman aralıklarını belirlemek için bir duyu nöronunun ikiye ayrılan aksonunun iki motor nöron ile sinaps yaptığı Aplysia kültür sisteminde protein sentezi blokeri kullanıldı. 5 oturumluk serotonin uygulaması ile LTF’un indüklenmesinin ardından etiketlenmiş sinapsa protein sentezi blokeri emetinin lokal olarak uygulanması 24 ve 48 saat anlarında LTF’u bloke ederken 72 saat anında herhangi bir etkisi olmadı. LTF’un bloke edildiği zamanda ise o ana kadar oluşmuş olan yeni sinaptik varikoziteler selektif olarak geri çekildi. Daha önce ele aldığımız gibi lokal protein sentezinin en önemli düzenleyicisi CPEB’dir ve CPEB’in bloke edilmesi de bu süreçleri bozar.

Bu bulgular toplu olarak değerlendirildiğinde 72 saatlik sürece kadar yeni oluşan varikozitelerin hala labil olduğunu ve daha stabil duruma geçebilmek için CPEB ile düzenlenen lokal protein sentezine ihtiyaç duyduklarını gösterir.

ThoughtCo

Drosophila'da Klasik Koşullanma

İnsandaki 86-100 milyar nöronun aksine Aplysia’nın 20,000 nöronu olduğunu ve bu canlıların yine de dikkat çekici öğrenme becerilerinin olduğunu görmüştük. Aynısı 100,000 nörona sahip Drosophila için de geçerlidir ve bu canlılarda klasik koşullanma oluşturulabilir.

Drosophila Melanogaster’de en yaygın çalışılan öğrenme ve bellek tipi olfaktör klasik koşullanmadır. Sineklerde klasik korku koşullanması oluşturmak için bir koku CS olarak ve elektrik şoku gibi negatif bir uyaran ise US olarak kullanılır. Daha sonra koşullanma belleği sineklerin iki kokudan birisini seçeceği bir T-maze (iki kola ayrılan bir labirent)’de test edilir. Kokulardan biri CS’ken diğeri eşlenmemiş bir kokudur. Bu prosedür belleğin kısa, orta ve uzun-dönem çalışılmasına izin verir. Eğitim sonrası sineklerin büyük kısmı CS’dan kaçınmıştır. Bazı mutant sinekler CS’dan kaçmayı öğrenememiştir ve bu sineklerde çok sayıda genetik defekt tanımlanmıştır. Bu genetiklerin ciddi bir kısmı cAMP yolunda görülmektedir.

Olfaktör koşullanma uyarıların, sinek beyninde Kenyon hücrelerinde kesişmesine bağlıdır. Bu hücreler hem olfaktör hem de US gibi zararlı bir uyaranı ileten dopaminerjik nöronlardan girdi alır. Dopamin Ca²⁺/Calmodulin bağımlı tip bir adenil siklaz enzimini aktive eder ve olfaktör uyarı ile konverjans olursa Aplysia’da görülene benzer bir etkiyle cAMP artışları daha güçlü olur.

UCSD

Drosophila’da uzun-dönem bellek oluşumu da protein sentezini gerektirir. CPEB’in homoloğu olan Orb2’nin uzun-dönem belleğin korunmasında rolü vardır. Bu proteinin inhibe edilmesi belleğin başlangıcını engellemezken uzun-dönem belleği engeller.

Memelilerde İmplisit Bellek

Memelilerde implisit olarak öğrenilmiş korku, memeli beyni ile sinaptik plastisite arasındaki en güçlü kanıtlardan birini sunar. Freud ve Pavlov nötral bir stimulusun korku ile ilişkilendirilebileceğini ortaya koymuştur. Örneğin, bir ses tonu ve ayağa uygulanan bir şok ile klasik koşullanma ortaya çıkarılabilir ve sadece sese cevap olarak hayvanda korku cevabı gözlenebilir. Memelilerde korku öğrenme süreci amigdalayı içerir. Amigdala işitsel ve nosiseptif uyarıları hem doğrudan talamustan hem de dolaylı olarak neokorteksten alır.

Frontiers

Bir ton ve şokun eşleştirilmesi amigdalanın işitsel uyarılara cevabını güçlendirir. Güçlenmeye aracılık eden süreç NMDA reseptörlerinin dahil olduğu ve amigdala nöronlarında AMPA reseptör sayısının ve iletkenliğinin artışını içeren long-term potentiation mekanizmasıdır. Eğer tonun ardından şok gibi bir uyaran sunulmazsa ve bu defalarca tekrar edilirse, bu kez amigdalada long-term depression mekanizması görülür. Yani, öğrenilmiş korkunun ortadan kalkması aynı süreçlerin basitçe tersine dönmesi değildir ve ayrı bir mekanizmayı içerir ve aslında öğrenilmiş bilgiyi (korku) unutma değil, yeni bir şey öğrenme sürecidir.

Son olarak, memelilerde öğrenme süreci de, çok daha karmaşık olmasına rağmen, PKA, MAPK, CaMKII, CREB, CPEB, PKMζ gibi proteinler aracılığıyla gerçekleşir.

Sonuç ve Genel Perspektif

Geçtiğimiz 50 yılda araştırmacılar öğrenme ile ilişkili sinaptik plastisitenin altında yatan moleküler mekanizmalar ile ilgili büyük ilerlemeler kaydettiler. Bu bilgiler başlangıçta büyük ölçüde görece basit sinir sistemine sahip canlılar üzerinde yapılan çalışmalardan elde edildi. Daha sonra araştırmalar memelilerin karmaşık sinir sistemlerine uzandı.

Aplysia’da LTF’dan elde ettiğimiz bilgilere göre belleğin farklı fazlarını şu şekilde özetleyebiliriz: Kısa-dönem bellek mevcut proteinlerin modifikasyonlarıyla sinaptik transmisyonun etkinliğindeki kısa süreli değişiklikleri içerir. Orta-dönem bellek protein sentezini gerektirirken, transkripsiyonu gerektirmez ve sessiz sinapsların hızlı aktivasyonu görülür. Uzun-dönem bellek gen ekspresyonu ve somatik translasyon ile sağlanır ancak lokal protein sentezinden bağımsızdır ve yeni sinaptik bağlantılar oluşur. Uzun-dönem belleğin korunmasında ise bireysel bir sinapsta lokal protein sentezinin rolü ön plana çıkar ve sonuçta bilginin uzun bir dönem boyunca korunma süreci başarılmış olur. Ancak akılda tutulmalıdır ki Aplysia'da tanımlanan sinaptik plastisite mekanizmaları tüm canlılar için geçerli olsa da, nöronların alternatif çok sayıda plastisite stratejisi mevcuttur. Örneğin, bazı plastik değişiklikler Aplysia'da olduğu gibi presinaptik mekanizmalar ile başlatılırken, bazıları postsinaptik mekanizmalar ile başlatılır.

Canlıların çevrelerine adapte olabilmeleri için vazgeçilmez olan bellek mekanizmaları evrimsel süreçte çok erken bir dönemde ortaya çıktı. cAMP-PKA-CREB yolu, CPEB gibi fonksiyonel prionlar ve PKMζ belleğe aracılık eden majör proteinlerdendir ve omurgasız canlılardan primatlara çok farklı türlerin evrimi boyunca korunarak aktarılmıştır.

The New York Times

Eric Richard Kandel “belleğin peşinde” geçirdiği bir ömür boyunca hem yaptığı çalışmalar hem de yetiştirdiği öğrenciler ile bu alana en büyük katkıyı sağlayan bilim insanlarından birisidir. 1929 doğumlu büyük sinirbilimci çalışmalarını hala büyük bir yaratıcılık ile sürdürmektedir. Kandel bu araştırmalarından dolayı 2000 Nobel Fizyoloji veya Tıp ödülü ile ödüllendirildi.