DNA Dizileme Yöntemleri: Genleri Nasıl Diziliyoruz?

Genlerin dizilenmesi ve bundan doğan yepyeni analizler, bilimin gidişatını kökünden değiştiren müthiş bir gelişmedir. Çünkü bu sayede ilk defa evrimsel biyolojinin öngörüleri genetik olarak da doğrudan test edilebilmiştir. Sonucun beklenildiği gibi olması, evrimin bilim içerisindeki yerini bir daha ayrılmaz bir şekilde sağlamış oldu: gerçekten de türler arasında önceden görülen akrabalıklar genetik olarak doğrulandı, hatta bazı fosillerden elde edilen genlerle atasal türlerle torunlar arasındaki ilişkiler tespit edildi, türlerin ortak atalarından farklılaşma zamanları ve hatta hızları belirlendi, mutasyonların evrime etkisinin detayları anlaşıldı, popülasyonların içerisindeki çeşitliliğin o popülasyonun evrimiyle ilişkisi belirlendi, daha önceden yapılan bazı hatalı öngörüler düzeltilebildi, Evrim Ağacı'nın dalları ve bu dalların birbirleriyle ilişkisi netleştirildi ve daha nicesi... Öyle ki, evrimle genetiğin bütünleştirilmesi, bilimde "Modern Sentez" denen bir bütünleşmeyi başlattı, bilimin geleceğine yön verdi. Bu makalemizde genetiğin evrime güç verdiği en önemli noktada, gen dizilemesinde atılan adımlardan ve bu alandaki bazı önemli bilim insanlarından bahseddeceğiz.

19 Kasım 2013'te 2 farklı Kimya Nobel Ödülü’ne sahip bir bilim insanı aramızdan ayrıldı, ülkemizde yankı oluşturmamış olsa da, bu bilim insanı dünyada “Genetik Biliminin Babası” unvanını almıştır. Frederick Sanger… Peki, neydi Sanger’i bu kadar ünlü yapan? İlk büyük başarısını proteinlerin kimyasal yapısını ortaya çıkaran teknikler geliştirip 1958 yılında Kimya Nobel Ödülü’nü alarak yaşayan Sanger, bu başarısının ardından DNA ile ilgilenmeye başlamış ve bir virüsün genom dizisini ortaya çıkarmıştır. Kendi adıyla anılan (Sanger Dizileme) yöntem ile de 1980’de bir kez daha Kimya Nobel Ödülü’ne layık görülmüştür. Bir dalda 2 Nobel ödülü alan tek bilim insanı olması da başka bir başarısı. Fakat bu yazımızda Sanger’in hayatından ve başarılarından çok, bilime, özellikle de genetik bilimine verdiği katkılara değinmeye çalışacağız.

Sanger genetik biliminin babası unvanını almış olsa da, bu bilim dalının temellerini atan kişi Mendel’dir. Dolayısıyla belki de Mendel için "Genetiğin Babası", Sanger için de "Modern Genetik Biliminin Babası" şeklinde bir ayrıma gitmek gerekir. Mendel, 1856 yılında bezelyeler üzerinde yapmaya başladığı araştırmalar sonucunda, yaptığı araştırmalar o günlerde mayoz ve mitoz bölünme gibi bölünme çeşitleri bilinmediğinden sadece görülen özelliklere bağlı olmuştur, çoğu özelliklerin kalıtımın kural ve orantıları ile açıklanabileceğini öne sürmüştür. Fakat onun çalışmaları da diğer çoğu büyük bilim insanının çalışmalarına ilk başta verilen tepkiyi aldı, fakat Mendel bunları önemsenmedi. Ölümünden 16 yıl sonra Hollanda’da Hugo De Vries, Almanya’da Carl Correns ve Avusturya’da Erich von Tschermak adlı üç biyolog, çeşitli bitki türlerinde, birbirlerinden habersiz yaptıkları araştırmalarda, Mendel yasalarının geçerliliğini gösterdiler ve tüm sonuçları "Mendel Yasaları" adı altında toparladılar. 

Bilimin ilerlemesi sayesinde artık kromozomları genleri içerdiği, proteinlerden ve DNA’dan oluştukları öğrenildi. 1952 yılında Hershey – Chase deneyi de, virüslerin genetik maddesinin DNA olduğu, diğer maddelerin kalıtımdan sorumlu olmayacağını kanıtladı. Devam eden yıllarda Maurice Wilkins, Francis Crick ve James Watson, Rosalind Franklin’in X-ışını kırınım çalışmasından yararlanarak DNA’nın çift sarmal bir yapıda olduğunu kanıtladı. Devam eden araştırmalar DNA’nın moleküler yapısının anlaşılmasını ve biyolojideki yeni bilgiler kullanılarak bir araştırma patlaması oluşmasını sağladı. 

Margreet de Heer

Genetik biliminin gelişimini hızlı bir şekilde verdikten sonra DNA’nın ne olduğundan bahsedelim biraz da. Watson - Crick modelinin de açıkladığı üzere DNA çift sarmaldan, yani çift zincirden oluşmaktadır. Bu sarmalı düz bir şekilde getirirsek bir merdivene benzer ve bu merdivenin her bir basamağını oluşturabilmek için karşılıklı zincirlerdeki karşılıklı bazlar birbirine bağlanmaktadır. Bir zincirde 4 çeşit baz bulunabilir; Adenin, Sitozin, Guanin ve Timin. Kimyasal yapılarından ötürü bu bazlardan Adenin Timin ile, Guanin de Sitozin ile bağ kurabilir. Bazların farklı bağlanma sıraları ise bizim genetik çeşitliliğimizi oluşturur. 

Gen Dizilemenin Zorlukları ve Sanger'in Başarısı

Bunun da keşfedilmesi ile bilim insanları bu dizimin ya da farklı bağlanma sıralarının haritalarını çıkarmak istediler. İlk zamanlarda bu dizileme çalışmaları çok uzun sürmekte ve çok zahmetli bir iş olmaktaydı. RNA dizilemesi baz dizilemesinin ilk basamağı oldu. Gent Üniversitesi’nden Walter Fiers ve arkadaşları 1972 yılında Bakteriyofaj MS2’ye ait bir genin dizisini çıkardılar. 1973 yılında ise, zahmetli bir yöntem olan Wandering-Spot Analiz yöntemi kullanılarak 24 bazın dizisini yayınlandı. Fakat 1975 yılına gelindiğinde, Frederic Sanger ve çalışma arkadaşlarının bu alana el atması ve Zincir Sonlandırma Yöntemi (ya da Sanger Yöntemi)’nin geliştirilmesi sayesinde hem daha kolay hem de daha güvenilir olduğundan ötürü bu yöntem kullanılmaya ve daha hızlı veri elde edilmeye başlandı. Tabii bu sadece bir başlangıçtı, başka yöntemlerin keşfedilmesi, 1986 yılında ilk yarı otomatik DNA dizileme makinesinin bulunması ve bilgisayarların da kullanılmaya başlanmasıyla günümüzde DNA dizilemesi son derece hızlı bir şekilde gerçekleştirilmektedir. 

Sanger’in ardında birçok yeni dizileme yöntemleri geliştirildi. Bu yöntemleri Basit yöntemler, ileri yöntemler ve yeni nesil yöntemler olarak 3 genel başlık altında toplayabiliriz. En eski dizileme yöntemleri tahmin edebileceğiniz gibi Basit Yöntemler başlığı altında anlatacaklarımızdır. Bunlar da Zincir Sonlandırma ve Maxam – Gilbert yöntemleridir. Öte yandan, diğer başlıklar altında anlatacağımız yöntemlerin hepsinin kendine has kolaylıkları vardır ve kullanıldıkları alanlar farklılık göstermektedir. 

Basit Dizileme Yöntemleri

1 - Zincir Sonlandırma Yöntemi (Sanger Yöntemi)  

Klasik yöntem için tek iplikli bir kalıp DNA, primer DNA, DNA’nın kendini klonlamasını sağlayacak olan DNA polimeraz, deoksinükleotitler, yani dNTP’ler, (DNA’nın yapıtaşını oluşturan dATP, dGTP, dTTP, dCTP moleküllerine verilen genel isim) ve zincir büyümesini sonlandıran modifiye edilmiş bazlar kullanılır. Bu bazlar dizileme makinalarında, otomatik olarak tespit edilmek için, radyoaktif olarak işaretlenir. DNA numunesi 4 ayrı reaksiyon için (A, T, G, C bazları için ayrı ayrı yapılacak olan) paylaştırılır ve bunlarda ortak olarak deoksinükleotit bulunur. Ardından her numuneye bir tane baz eklenir, bazlarla deoksinükleotitler arasında bağ kurulamadığından DNA zinciri daha fazla uzayamaz ve reaksiyon sona erir. Böylece elimizde farklı uzunluklar DNA zincirleri bulunur.

Bu zincirler ısıtılarak yapıları bozulur ve sonrasında kullanılan yöntemlerle büyüklüklerine göre ayrıştırılır. Biraz daha açacak olursak, dört reaksiyondan elde edilen DNA parçaları bir jel içine konarak elektrik alana maruz bırakılır ve bu parçalar birbirlerine paralel yollar alarak birbirinden ayrılır. 

İlk başlarda bu yöntem gayet güvenilir ve ekonomik olmuş olsa da zamanla yeni yöntemler gelişmiş ve bu yöntemi de geliştirmeye itmiştir. Birazdan bahsedeceğimiz Maxam – Gilbert yöntemi ilk çıktığı zamanlarda bu yöntem yerine tercih edilmeye başlanmış olsa da zamanla bu yöntem geliştirilerek eski popülerliğine ulaştırılmıştır. Şuanda da farklı Zincir Sonlandırma metotları mevcuttur. Örneğin optik bir sistemde yapılan boya- primer dizilemesi sayesinde okuma daha hızlı ve ekonomik olur. Bu yöntem Leroy Hood ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemi hızlı kılan ise, zincir sonlandırıcı bazlar işaretlenerek 4 ayrı reaksiyonda gerçekleştirilen dizileme tek reaksiyonla gerçekleştirilebilir. 

2 - Maxam – Gilbert Dizilemesi 

Bir diğer basit yöntem ise 1977 yılında, Harvard Üniversitesi’nden Alan Maxam ve Walter Gilbert tarafından, DNA’nın kimyasal modifikasyonu ve onun belli bazlarda kesilmesi yöntemine dayanan dizileme yöntemidir. Bu yöntemin makalesi Sanger Dizileme Yöntemi’nden 2 yıl sonra basılmış olsa da zamanla onun yerini almıştır. Bunun sebebi Zincir Sonlandırma Yönteminin DNA’yı klonlamak istemesi ve 4 ayrı reaksiyon ile gerçekleşiyor olmasına rağmen bu yöntemin saflaştırılmış bir DNA numunesinin direk olarak dizilenebiliyor olmasıdır. Fakat Sanger Yönteminin zamanla geliştirilip iyileştirilmesi Maxam – Gilbert yönteminin popülerliğini kaybetmesine sebep oldu, zira bu yöntem hem çok karmaşık olduğundan moleküler biyoloji çalışmalarında kullanılamıyor, hem de zararlı kimyasallar kullanılması gerektiği için kullanışlı değildi, ölçeklenmesi de zordu.

Çok karışık bir yöntem olduğu için ayrıntısına burada yer vermek istemiyor ve diğer dizileme yöntemlerine geçiyoruz.

İleri Dizileme Yöntemleri

Bu yöntemler genel olarak tüm kromozom gibi uzun DNA parçalarının dizilenmesinde kullanılır. Yaygın kullanılan yollardan biri büyük DNA parçalarını restriksiyon enzimleri veya mekanik güçler kullanarak küçük parçalara ayırmaktır. Parçalanmış DNA bir DNA vektörü içine klonlanır ve Escherichia coli bakterisi içinde çoğaltılır. 

1 – Av Tüfeği Dizilemesi

Bu yöntem 1000 bazdan daha uzun olan ve tüm kromozomu içeren bir dizileme yöntemidir. Bu dizilemeyi kullanabilmek için DNA’nın rastgele kırılmış olan bir parçasının elimizde olması gerekir. Bu kopan/koparılan parça dizilendikten sonra, kendi örtüşen parçasına benzer. 

2 – PCR Köprüsü 

Laboratuvar koşullarında yapılan klonlama ile elde edilen dizileme yöntemidir. Bu metot Illumnia Genom Analiz Dizleme şirketince kullanılır. Sadece bu yöntem ile moleküler büyütme olmaksızın, lazer ışınları ile baz etkinlikleri görüntülenir. 

Yeni Nesil Dizileme Yöntemleri

Ucuz ve hızlı yöntemlere duyulan ihtiyaç, eski yöntemlerin geliştirilmesine ve yeni yöntemlerin bulunmasın yol açtı. Yeni nesil yöntemler ile bir seferde binlerce hatta milyonlarca diziler aynı anda üretilebilir. 

1 – Kitlesel Paralel Dizileme 

"Gelecek kuşak" dizileme teknolojilerinin ilki olan Kitlesel Paralel İmza Dizilemesi, 1990'larda Lynx Therapeutics'te geliştirilmiştir. Bu şirket 1992'de Sydney Brenner ve Sam Eletr tarafından kurulmuştur. MPSS, boncuk temelli bir yöntemdi, bir bağlama ve onu takip eden bir şifre çözme adımı içeriyordu ve dizi dört nükleotitlik birimler halinde okunuyordu. Bu yöntem diziye özgü taraflılığa ve özel dizilerin kaybına yol açıyordu. Teknoloji çok karmaşık olduğu için MPSS sadece Lynx Therapeutics tarafından bir hizmet olarak sunulmaktaydı ve dizileme makinası satılmıyordu. Daha sonradan 2004 yılında Solexa ile şirket evliliği olunca bu teknoloji, sentez yoluyla dizilemenin gelişmesine yol açtı, çok daha basit olan bu yeni yaklaşım sayesinde MPSS kullanılmaz oldu. Ancak, MPSS çıktısının esas özellikleri daha sonra gelen "yeni nesil" veri tiplerine çok benzemekteydi. Ve son olarak bu şirket de Illumina tarafından satın alındı.

2 – Poloni Dizilemesi 

Harvard'da George Church'ün laboratuvarında geliştirilen poloni dizilemesi, 2005'te tüm bir genomu dizilemek için kullanılan ilk yeni nesil dizileme sistemleri arasındaydı. Bir çok dizileme yöntemde kullanılan özellikleri birleştirerek bir E. coli genomunu %99.9999'dan yüksek bir doğruluk üretebilmiş ve bunun maliyetini Sanger dizilemesinin yaklaşık 1/10'una getirmiştir. Bu teknoloji önce Agencourt Biosciences şirketine lisanslanmış, daha sonra ana şirketten ayrılan Agencourt Personal Genomics'e aktarılmış ve son olarak Applied Biosystems'in SOLiD dizileme platformuna dâhil edilmiştir.

3 – Solexa Dizilemesi 

Solexa tersinir boya sonlandırıcılarına dayanan dizileme teknolojisini geliştirmiştir. DNA molekülleri bir lam üzerindeki ana parçalara bağlanır, sonra çoğaltılarak yerel, klonlanmış koloniler oluştururlar (Köprü Dizilemesinde kullanılan yöntem gibi). Dört tip baz eklenir, dahil edilmeyen nükleotitler yıkanıp atılır. Bir kamera ile floresan işaretli nükleotitlerin resmi çekilir. Sonra 3. Karbona yerleştirilmiş olan zincir uzamasını durduran madde ve floresan boya beraberce kimyasal olarak çıkarılır ve bir sonraki döngü başlar.

4 – DNA Nanotop Dizilemesi

DNA nanotop dizilemesi Complete Genomics şirketi tarafından geliştirilmiş bir dizileme yöntemidir. Yöntem, dönen çember ikileşmesi kullanarak genomik DNA'dan elde edilmiş küçük parçaları çoğaltıp bunlardan DNA nanotopları meydana getirmektedir. Bağlanma yoluyla dizileme ile nükleotit dizisi belirlenir. Bu yöntem bir defada çok sayıda DNA nanotoplarının dizilenmesini sağlar ve diğer yeni nesil dizileme platformlarına kıyasla daha düşük masrafı vardır. Ancak, her bir DNA nanotopundan sadece kısa diziler elde edilir, bu yüzden bu kısa dizilerin bir referans genomu üzerinde haritalanması zordur. Bu teknoloji çeşitli genom dizileme projelerinde uygulanmıştır.

5 – 454 Pirodizilemesi 

Pirodizilemenin paralelleştirilmiş bir versiyonu 454 Life Sciences tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde bir yağ çözeltisi içindeki su damlacıklarında yer alan DNA, PCR (hedeflenen bir diziyi enzimlerle çoğaltmak için kullanılan yöntemin adı) ile çoğaltılır. Tek bir DNA kalıbının tek bir primer kaplı boncuğa bağlı olduğu her damlacık, sonra klonal bir koloni oluşturur. Dizileme makinası çok sayıda pikolitre (litrenin 1012 kat küçüğü olan bir birim) hacimli kuyulara sahiptir, bunların her biri tek bir dizileme enzimleri içerir. Pirodizilemede lüsiferaz enzimi kullanılır, bu enzimin ürettiği ışık ile büyümekte olan DNA'ya eklenen her bir nükleotit tespit edilir. Veriler birleştirilerek dizi okumaları üretilir. Bu teknoloji orta uzunlukta diziler üretir, baz başına maliyeti çok yüksek değildir.

6 – SOLiD Dizilemesi

Applied Biosystems'in SOLiD teknolojisinde bağlanma yoluyla dizileme yöntemi kullanılır. Burada, belli uzunluktaki tüm olası oligonükleotitlerin (birkaç nükleotidden oluşmuş DNA parçaları) bir karışımı dizilenen konuma göre işaretlenir. Oligonükleotitler ayarlanır ve ligasyona uğrar; DNA ligazın (2 DNA’nın ucunu birleştiren özel bir enzim) birbiriyle eşleşen dizileri bağlama tercihi nedeniyle, o pozisyon için bilgilendirici bir sinyal elde edilir. Dizilemeden önce DNA, PCR ile çoğaltılır. Elde edilen parçaların her birinde aynı DNA'nın kopyaları bulunmaktadır, bu parçalar bir cam lamın üzerine yerleştirilir. Sonuç, Illumina dizilemesine benzer sayı ve uzunluklarda dizilerdir.

7 – İyon Yarı İletken Dizilemesi 

Ion Torrent Systems Inc. iyon yarıiletken dizilemesine dayalı bir sistem geliştirmiştir. Bu dizileme yöntemi, DNA'nın oluşumu sırasında açığa çıkan hidrojen iyonlarının tespitine dayalıdır. Dizilenecek bir kalıp DNA ipliği içeren bir mikro-kuyu, tek bir nükleotit tipi ile doldurulur. Eğer eklenen nükleotit uzayan zincire dâhil edilebiliyorsa bu bir hidrojen iyonunun salınmasına yol açar, bu da çok hassas bir iyon sensorunu uyarır. Eğer kalıp dizide aynı nükleotitten peş peşe birkaç tane varsa, bir döngüde birden çok nükleotit zincire katılacaktır. Bu durumda daha çok sayıda hidrojen iyonu salınacak ve orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyal elde edilecektir.

26 Haziran 2000 yılında ABD başkanı Bill Clinton, İngiltere başkanı Tony Blair ve araştırmayı yapan özel şirketleri temsilen Celera Genomics yetkilileri 1990 yılında başlayan İnsan Genom Projesi’nin ilk ayağını tamamladıklarını dünyaya duyurduklarında 21. Yüzyılın belki de ilk bilimsel gelişmesiydi ve bu gelişme ilerleyen yıllarda genetik bilimine daha da ivme kazandıracaktı. Öncesinde gerçekleşmiş birçok tartışma ve sonrasında da gerçekleştirilen tartışmalar ve de etik olup olmadığı bir kenara, bu proje özellikle tıp açısında birçok kolaylık ve yenilik getirdi.

Bu proje insan genomundan 175.000 baz çiftinin yapay bakteri kromozomu haline getirip bakterilerde çoğaltılarak gerçekleştirilmiştir, yani PCR köprüsü yöntemi kullanılmıştır. 

Ayrıca bu Genom Projesi, Boğaziçi Üniversitesi’nin liderliğinde ülkemizde de gerçekleştiriliyor. Şimdiye dek 17 Türk vatandaşının genom dizilimi çıkarıldı. 

Bir diğer önemli gelişme ise Almanya’dan. Max Planck Evrimsel Antropoloji Enstitüsü’nce yapılan araştırmalar sonucu 400,000 yıllık Hominid’in mitokondriyal DNA’sını dizileyerek, şimdiye kadar ortaya çıkarılan en yaşlı genom dizilimini elde etmiş oldular. Matthias Meyer ve ekip arkadaşları, geliştirdikleri yeni kurtarma ve dizileme yöntemiyle, sadece 2 gram kemikten mitokondriyal DNA elde ederek bunun genom dizilimini çıkardılar. 

Ve son gelişme de Amerika’dan. 2010 yılında Arizona Üniversitesi Biyodizayn Enstitüsü’ndeki bilim insanları Amerikan Hükümeti tarafından 1.2 milyon TL’lik bir teşvik ödülü kazanmış DNA dizilimi üzerine yaptıkları çalışmaların düşük maliyetli olmasından ötürü. Bu teşvikteki amaç ise DNA dizilemesini en az maliyete indirmek. 2009 yılında ise Uluslar Arası İnsan Genom Araştırmaları Enstitüsü 3 milyar bazlık genom dizilemesini 100.000 Dolar’a kadar indirmişti. Günümüzde ise bu fiyat 40.000 Dolar’ın dahi altına çekildi.  

Genetik özellikle 21. Yüzyılın parlayan yıldızı konumunda. Bir yandan tamamlanan İnsan Genom Projesi, bir yandan hastalıklara sebep olan genlerin bulunması öteki yandan gen terapilerinin gelişmesi bizi daha güzel bir geleceğin beklediğini gösteriyor. 

Mendel’den başlayarak, James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin ve daha niceleri bu alana sonsuz derecede katkıda bulundular. Fakat bu yazımızda özel teşekkürümüzü, dizileme yöntemlerinin gelişmesini şahlandıran, yeni yöntemleri tetikleyen ve kendisi de bulduğu dizileme yöntemiyle, eski ve uğraştırıcı yöntemleri kenara iten Frederick Sanger’e...