DNA Dizileme Yöntemleri: Genler Nasıl Dizilenir? Yeni Nesil DNA Sekanslama Yöntemleri Nelerdir?

DNA, canlıların bütün genomik verilerini içerisinde bulunduran, hücrelerin "yönetici molekülü"dür. DNA, içerisinde bulunan bilgileri (genleri) RNA’lar aracılığıyla protein şeklinde ifade eder. DNA’nın sekanslanması (dizilenmesi), DNA’daki nükleotit dizilimlerini çözmek, yani aslında DNA’yı okumak anlamına gelir.

Genomların sekanslanması, DNA’nın yapısının 1953’de Franklin, Watson ve Crick tarafından aydınlatılmasının ardından, biyologlar tarafından üstünde çalışılan bir konu olmuştur. Özellikle insan genomunun sekansının aydınlatılması, genetik hastalıkların tedavi edilmesine giden sürecin ilk basamağı olduğu için ayrı bir önem kazanmıştır.

Yeni nesil yöntemleri incelemeden önce ilk olarak temel yöntemlerden ve esasında yeni nesil yöntemlere temel fikirlerini veren metotlardan bahsetmek daha doğru olacaktır.

Birincil Nesil Sekanslama Yöntemleri

Maxam-Gilbert Metodu

1970’li yıllarda iki-boyutlu kromatografi yöntemlerinin ilerlemesiyle protein ve DNA’ları kütle, büyüklük, yük gibi özelliklere bağlı olarak ayırt etmek ve saflaştırmak çok daha kolay bir hale gelmiştir. DNA’nın sekanslanması ilk olarak 1976-1977 yıllarında, Harvard Üniversitesi’nden Allan Maxam ve Walter Gilbert tarafından Maxam-Gilbert adı verilen bir yöntemle gerçekleşmiştir.

Bu yöntemde DNA zincirinin 5’ ucunda bulunan fosfat grubunun radyoaktif fosfat (³²P) ile işaretlenir ve DNA saflaştırılır. G, A+G, C ve C+T nükleotidlerinin muamelesini içeren 4 farklı kimyasal reaksiyon seti şeklinde, bu nükleotitlerin bulundukları DNA konumundan kesikler oluşturulur. Belirli modifikasyonları sağlayan enzimlerin farklı konsantrasyonlarda kullanılmasıyla her DNA molekülü başına az sayıda modifikasyon oluşması sağlanır. Modifiye olmuş DNA parçaları kesilerek elektroforeze sokulur ve 4 farklı reaksiyonu ifade eden 4 farklı kolondaki bantlara göre aşağıdan yukarıya yani kısa zincirlerden uzun zincirlere doğru okuma yapılır.

NCBI

Bu yöntem, sonradan popülerleşecek olan ve aşağıda değineceğimiz Sanger’in makalesinden iki yıl sonra bulunmuş olsa da, kısa sürede popüler hale gelmişti; çünkü Sanger’da olduğu gibi DNA kalıbının çoğaltılmasına ihtiyaç duymadan, tek bir DNA’yı işaretleyip kullanmayı mümkün kılıyordu. Ancak Sanger’in, yöntemini zincir sonlandıran terminatörler ile destekleyip okumanın daha otonom ve kolay olması için boyalar eklemesi, 4 farklı reaksiyon kullanan bu yöntemin terk edilmesine sebep olmuştur.

Sanger Metodu

Zincir sonlandırma metodu, bu yöntemi bulan bilim insanına ithafen, Sanger Metodu olarak da adlandırılır ve temelde zincirin sentezini sonlandırmaya yarayan dideoksinükleotitler (ddNTP) kullanılmasına dayanır. Dideoksinükleotitlerin normal deoksinükleotitlerden farkı, 3’OH grubu yerine 3’H grubu içermeleridir. DNA’da iki nükleotitin bağlanması ile oluşan fosfodiester bağları, oluşmak için 5’P ve 3’OH grupları gerektirir. Zincirin sonuna eklenen nükleotit 3’OH grubu içeren normal bir dNTP yerine bir ddNTP türevi ise, bu nükleotidin sonrasında gelen bir nükleotit ile bağ kurması mümkün olmayacaktır ve zincir sentezi sonlanacaktır.

Sanger metodunda bu sona gelen ddNTP’ler floresan bir boya ile işaretlenerek (ddATP, ddTTP, ddGTP ve ddCTP’nin her biri için farklı bir renk atanır.) sekanslanması amaçlanan çok sayıda tek iplikli DNA’nın ve DNA sentezini yapacak polimerazın bulunduğu bir ortama aktarılır. Sentez gerçekleştiği sırada bir DNA fragmentine eklenen ddNTP, sentezi farklı baz konumlarında durdurur ve türüne göre bir renkte floresan ışıma yapan farklı uzunluktaki DNA zincirlerinin oluşmasını sağlar. Bu ışımanın dalga boyu bir detektör ve bilgisayar tarafından algılanır ve dalga boyuna göre nükleotit türü belirlenmiş olur. Flüoresan boyaların kullanımından önce farklı bir dideoksinükleotid işaretleme yöntemi, radyoaktif işaretleme olmuştur ve flüoresan tekniğinin aksine 4 farklı jel bandında, işaretlenmiş 4 farklı nükleotid tipini içerir.

ScienceDirect

Sanger yöntemi sekanslama konusunda yeni bir çağ başlatmış, biyoteknolojinin önem ve hız kazanmasını sağlamıştır. Bunların yanında Sanger metodu tam genom sekansı gibi konularda oldukça yetersiz kalmıştır. Bu yetersizlik, yeni yöntemlerin bulunmasını teşvik etmiş ve günümüzde çok efektif metodlar geliştirilmiştir. Yeni nesil sekanslama yöntemlerine genel olarak NGS (Next-generation sequencing) adı verilir.

Yeni Nesil Sekanslama Yöntemleri Nelerdir?

Illumina Sekanslama

Tarihçesi

Illumina sekanslama yöntemi, sentez yoluyla sekanslama yollarından bir tanesidir ve tek bir çalışmanın değil, bir sürecin ürünüdür. Bu çalışmaların temeli ilk olarak 1990’lı yılların ortasında, Cambridge Üniversitesi’nden Shankar Balasubramanian ve David Klenerman tarafından atılmıştır. Bu bilim insanlarının özellikle 1997’de ortaya attığı fikirler, daha sonrasında sentez yoluyla sekanslama fikirlerinin temelini oluşturmuştur. Bu bilim insanlarının fikri temel olarak, üretilen kısa sekans dizilerinin katı bir fazda paralel okunmasını içermekteydi.

Balasubramanian ve Klenerman, 1998’de aldıkları fon ile Solexa şirketini kurmuş ve 2000 yılındaki binalarına yerleşene kadar Cambridge’in Kimya Laboratuvarlarını kullanmışlardır. Bu şirket 2001 yılında, İsveç kökenli bir biyoteknoloji şirketi olan Manteia'dan aldıkları moleküler kümeleme (İng: "clustering") teknolojisi sayesinde yalnızca tek bir DNA molekülünü, maliyetini düşürerek ve sentezin doğruluk yüzdesini artırarak çoğaltma olanağına sahip oldular. Bundan bir yıl sonra ekip, ilk kez Sanger'in kendi yöntemini kullanarak dizilediği phi X-174 bakteriyofajının tüm genomunu SBS (sentez yoluyla sekanslama) ile sıraladı. SBS teknolojisi, önemli ölçüde daha fazla veri üretti ve tek bir prosedürde 3 milyondan fazla baz verisi verdi. 2006 yılında ise Solexa kendine ait ilk sekans makinesini üretmiştir. Bu teknoloji 2007 yılında Illumina şirketi tarafından alındı ve geliştirilerek Yeni Nesil Sekanslama çalışmalarına öncülük etti.

Neden Kullanılır?

Illumina sekanslama yöntemi, tek bir döngüde milyon bazlara varan veri sağladığı ve hata oranı Sanger gibi eski yöntemlere kıyasla oldukça düşük olduğu için genellikle organizmaların tüm genomlarının sekanslanmasında ve GWAS (İng: "Genome Wide Association Study", Tr: "Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları") araştırmalarında kullanılır. GWAS araştırmaları, hastalıklarla ilişkili SNP’lerin yani tek nükleotitlik değişimlerin ortaya çıkarılmasını hedefler. Bunun yanında Ekson sekanslama çalışmalarında da kullanılmaktadır.

Nasıl Çalışır?

Illumina boyama temelli sekanslama yöntemi en temel düzeyde üç adımdan oluşur: çoğaltma, dizileme ve analiz. Süreç DNA’nın saflaştırılması ile başlar. Saflaştırılan DNA parçalanır (yani fragmentlere ayrılır) ve referans noktası görevi gören segmentleri içeren adaptörler bu fragmentlere eklenir. Bu ekleme nano kuyu adı verilen ortamlarda gerçekleştirilir. Fragmentlerin adaptörlere bağlandığından emin olunduğunda “köprü yapılı çoğaltma" (İng: "bridge amplification") işlemi başlar.

Köprü yapılı çoğaltma, temelde DNA fragmentlerinin katı bir faza tutturulmasıyla gerçekleşen bir PCR işlemidir. Daha sonra, primerler ve modifiye edilmiş nükleotitler bu katı faza eklenir. Bu nükleotitler, tersinir bir 3'floresan blokerine sahiptir, bu nedenle DNA polimeraz, DNA fragmentlerine bir seferde yalnızca bir nükleotit ekleyebilir. Her sentez aşamasından sonra, bir kamera katı fazın fotoğrafını çeker. Bir bilgisayar, floresan etiketin dalga boyu tarafından hangi bazın eklendiğini belirler ve katı faz üzerindeki her nokta için bunu kaydeder. Her sentez aşamasından sonra, birleşmemiş fragmentler ortamdan uzaklaştırılır. Daha sonra 3 ’floresan terminal blok grubunu çıkarmak için bir “kimyasal blok çözme” adımı gerçekleştirilir. İşlem, tüm DNA molekülü dizilenene kadar devam eder.

Bu prosedürdeki işlem basamakları detaylı incelenecek olursa:

• Genomik kütüphane nasıl hazırlanır? DNA saflaştırıldıktan sonra bir genomik kütüphane oluşturulur. Bu genomik kütüphaneyi oluşturmanın iki farklı yolu vardır: sonifikasyon ve etiketleme. Etiketleme yönteminde transposazlar kullanılır. Transposaz enzimi DNA’yı 100 ila 500 baz çiftlik fragmentlere parçalar ve rastgele bir şekilde adaptörler ekler. Genomik kütüphane oluşturmanın diğer yolu olan sonifikasyon ise ultrasonik dalgalar ile DNA’nın parçalanması işlemidir. Dikkat edilmesi gereken nokta şudur: genomik kütüphane oluştururken gDNA, yani Genomik DNA kullanılır. Genomik DNA, ekzon, intron ve Alu dizileri gibi tekrar dizilerini, yani DNA elemanlarının tamamını içerir.

Illumina

• Peki bu adaptörler nedir ve ne işe yararlar? Adaptörler, DNA veya RNA’ların ucuna eklenen ve spesifik diziler içeren oligonükleotit dizileridir. Adaptörlerin bir görevi, oluşturulan DNA fragmentlerini çoğaltma işleminin gerçekleşeceği katı faza bağlamaktır. Bu katı faz akrilamid kaplı cam bir ortamdır. Adaptörlerin diğer görevi ise içerisinde bulunan altı nükleotitlik bir etiket ile fragmentlerin kimliğini oluşturmak, yani bir nevi seri numarası vermektir. Fragmentler adaptörlere bağlandıktan sonra, deneyde hata olmaması için katı faz yıkanır; böylece adaptöre bağlanmamış fragmentler uzaklaştırılır.

Illumina

• Köprü PCR (Bridge Amplification) yöntemi ne zaman uygulanır? Katı faza bağlanma gerçekleştikten sonra başlar. Bu yöntemin amacı, birbirinin aynısı yüzlerce DNA fragmenti üretmektir. Bu işlem sonrasında çoğaltılmış olan fragmentler ileri veya geri yönlü zincirlere ait olabilir, bu nedenle adaptörler sol ve sağ olmak üzere iki çeşit kullanılır. Bu PCR yöntemiyle fragment “kümeleri” oluşturulur. Bağlı olan fragmentler klasik bir PCR işlemi ile eşlenir ve çift zincirli bir yapı oluşur. Çoğaltılan örnekler de başlangıçta “köprü” şeklindedir ve katı ortama bağlı haldedir. Eşleme işlemi sona erdikten sonra zincirler denatüre edilip tek zincirli hale getirilir ve ayrı ayrı hallerde ileri ve geri zincirler elde edilir. Tüm bu sürece “köprü” çoğaltma işlemi denir.

Illumina

• Küme çoğaltma basamağı nedir? Köprü PCR sırasında oluşturulmuş ileri ve geri zincir fragmentlerinin sayısının çoğaltılması işlemidir. Farklı ileri ve geri fragmentlerin oluşturduğu gruplara küme (İng: cluster) adı verilir ve bu basamakta her kümedeki fragment çift zincirli hale gelecek şekilde eşlenip çoğaltılır. Bu basamağın amacı bir nevi kalite kontrolüdür. İleri ve geri zincirler birbirinin tamamlayıcısı olmalı, tüm ileri ve geri okuma çerçeveleri birbiriyle eşleşmelidir. Bir okuma dizisi, aynı kümedeki diğer okuma dizilerine yeterince benzemiyorsa, bir hata meydana gelmiş olabilir. Bazı laboratuvarların analizlerinde minimum %97 benzerlik eşiği kullanılmaktadır.

Illumina

• Klonal amplifikasyonun sonunda, bütün geri zincirlerin fragmentleri yıkamayla uzaklaştırılır ve geriye yalnızca ileri zincir fragmentleri kalır. Geri yönlü zincirlerin uzaklaştırılması, katı ortama tutunmayı sağlayan yapıların yalnızca sol veya sağ adaptöre eklenmesi ile mümkün olur. Ortama eklenen primer, ileri zincirin adaptör bölgesindeki primer bağlama bölgesine bağlanır. Daha sonrasında DNA polimeraz zincire floresan olarak etiketlenmiş bir dNTP ekler. 3 ucundaki floroforun (bir floresan kimyasal bileşik) varlığı sebebiyle sentez bloke olur ve polimeraz her döngüde yalnızca bir nükleotit ekleyebilir. Ortamdaki her nükleotit çeşidine farklı bir renk atanmıştır, yani eklenen farklı türdeki nükleotitler farklı türde emisyon yaparlar; bu sayede bilgisayar emisyon farklılıklarından nükleotitleri ayırt edebilir. Bilgisayara her sinyal geldikten sonra, yani nükleotit çeşidi belirlendikten sonra, florofor uzaklaştırılır ve yeni sentezlenen ipliğe bir tane nükleotit daha eklenmesi sağlanır. Bu süreç yeni zincirin sentezi sonlanana kadar tekrarlanır.

Illumina

• Veri analizi nasıl yapılır? Veri analizi, contig adı verilen, özdeş bölgelere sahip dizilerin örtüşen bölgelerinin üst üste getirilip sekansların okunması işlemidir. Binlerce contig dizisi bu şekilde örtüştürülerek ve sıralanarak sekans doğruluk oranı yüksek bir DNA dizisi elde edilir. Bu yöntem sayesinde, eğer bir referans fragment varsa, SNP’ler ve varyantlar da tespit edilebilir; bu sayede GWAS çalışmaları yürütülebilir.

Illumina

Illumina Sekanslamanın Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Illumina’nın köken aldığı Sanger metoduna göre en temel avantajı, aynı anda birçok fragment kullanıldığı için görece daha hızlı olmasıdır. Sanger metodunda her döngüde yalnızca tek fragment çeşidi kullanıldığı için sekanslama işlemi uzun sürmektedir ancak Illumina’da işlem daha hızlıdır. Bunun yanında Illumina fragment kümeleri kullandığı için sekanslamanın ne kadar doğru gerçekleştiğini kontrol etmek de mümkündür. Ayrıca Illumina sekanslama yöntemi örnek başına 1 ila 5 milyon veri okuması verebilir ki bu Sanger ile ulaşılması mümkün olmayan bir sayıdır.

Avantajlarının yanında Illumina sekanslamanın en büyük dezavantajı pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymasıdır. Çoğu yeni nesil sekanslama yöntemi gibi modifiye enzimlere ihtiyaç duymasa da Illumina sekanslamanın yapıldığı ekipmanlar ve yazılımlar oldukça pahalıdır.

İyon Yarı İletken Sekanslama

Tarihçesi

İyon-yarı iletkenli sekanslama yöntemi, yeni nesil, senteze bağlı sekanslama yöntemlerinden bir diğeridir. 2007 yılında Jonathan Rothberg tarafından kurulan Ion-Torrent şirketi tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir. Kullanmış olduğu yarı iletken çip kullanma fikri daha sonrasında Roche 454 adlı şirket tarafından geliştirilen sekanslama makinelerinde de kullanılmıştır.

Neden Kullanılır?

Büyük boyutlu genomlar sekanslanırken meydana gelebilen hatalar nedeniyle genellikle genomu büyük organizmaların DNA’sının sekanslanmasında değil mikrobiyal genom dizileme, mikrobiyal transkriptom dizileme, hedefli gen dizileme, amplikon dizileme veya genom kitaplıklarının doğruluğunun test edilmesi gibi küçük ölçekli uygulamalarda kullanılır.

Nasıl Çalışır?

Dizilenecek kalıp DNA ipliğini içeren mikro kuyu, tek bir deoksiribonükleotit trifosfat (dNTP) türü ile doldurulur. Dahil edilen dNTP, kalıpta önce gelen nükleotide komplementer ise, uzayan zincire dahil edilir. Bu işlem, bir ISFET iyon sensörünü tetikleyen ve bir reaksiyonun meydana geldiğini gösteren bir hidrojen iyonunun salınmasına neden olur. Kalıp dizide homopolimer tekrarları mevcutsa, çok sayıda dNTP molekülü tek bir döngüye dahil olacaktır. Bu, karşılık gelen sayıda serbest bırakılan hidrojen sayısındaki artışa ve orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyale yol açar. Bu teknoloji, ddNTP gibi değiştirilmiş nükleotid veya optik uygulamaların (farklı dalgaboyundaki ışıklar gibi) kullanılmaması açısından diğer sentez yoluyla sekanslama teknolojilerinden farklıdır. İyon yarı iletken dizileme; pH aracılı dizileme, silikon dizileme veya yarı iletken dizileme olarak da adlandırılır.

Bu sekanslama yöntemi şu basamakları içerir:

• Sekanslama aşamasında modifiye enzimler veya değiştirilmiş nükleotitler kullanılmadığı için yöntem nispeten daha basit ve otonomdur. Yöntemin temelinde, dNTP’ler kalıp DNA’ya komplementer olarak eklenirken kurulan kovalent bağ oluşumu yatmaktadır. dNTP’ler kovalent bağ kurarken açığa pirofosfat ve dedektörler tarafından tespit edilecek olan H+ iyonu çıkar. Bir nükleotit, yeni sentezlenen zincire, yalnızca kalıp zincirdeki nükleotide komplementer ise katılacaktır. İyon yarı iletken sekanslamada her bir reaksiyon kuyucuğuna sadece tek tip dNTP yüklendiği için, dedektör tarafından tespit edilen bir H+ salınımı varsa, zaten kuyuda tek tip nükleotit olduğu için eklenen nükleotidin hangisi olduğu belirlenir. Sekanslanacak dizinin tek sarmal kalıbının binlerce kopyası, içerlerinde DNA polimeraz ve her birinde farklı bir dNTP olan kuyulara yüklenir. Eğer sırada eklenmesi gereken nükleotit, kuyuya yüklenmiş olan ise DNA polimeraz reaksiyonu gerçekleştirir ve ortaya bir H+ iyonu çıkar. Açığa çıkan bu hidrojen iyonu kuyucuktaki çözeltinin pH’ını değiştirir ve ISFET dedektörü bu pH değişikliğini algılar. Eğer herhangi bir sinyal algılanmadıysa bu, mevcut bulunan nükleotidin kalıpta sırada gelen nükleotide komplementer olmadığı anlamına gelir. Bu nedenle kuyuya yüklenmiş olan çözelti yıkanıp yeni nükleotit türü eklenir. Gelişmiş makinelerde bu sistem otomatiktir ve nükleotitlerin hızlıca değiştirilmesi için akış kanalı kullanır.

Wikipedia

• Bu yöntemde tespit yöntemi olarak H+ konsantrasyonu algılayan transistörler kullanılır. Basitçe anlatmak gerekirse H+ konsantrasyonu, transistörün dedektöründen geçerken pozitif bir voltaj farklılığı yaratır. Bu yöntemde kullanılan ISFET (iyon sensitif tabla) dedektörü, pHFET (pH sensitif dedektör) gibi işlev görür, yani içerisinde bulunduğu pH değişimlerini voltaj farklılığı olarak algılayıp sinyal verir. Bu ISFET iyon dedektörü, bütün kuyuların altında bulunur. Bütün kuyular Bütünleyici Metal Oksit Yarı iletkeni (CMOS) ile kaplıdır. Reaksiyon sonucunda açığa çıkan hidrojen iyonu ISFET dedektörü tarafından algılanır ve CMOS devresine elektrik sinyali gönderilir. Kuyuda reaksiyonun gerçekleşip gerçekleşmemesine göre bilgisayar bu sinyali değerlendirir.

Wikipedia

İyon Yarı İletken Sekanslamanın Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Oldukça hızlı bir yöntem olması ve maliyetinin diğer sekanslama yöntemlerine göre düşük olması bu metodu öne çıkaran özellikleridir. Sentez döngüsü başına kullanılan solüsyon, enzim ve diğer malzemelerin maliyeti yaklaşık olarak 1000 dolar civarındadır; cihazın elektronik aksamı ve yazılımları ise 50 bin dolar kadardır. Bu yöntemde saatte yaklaşık olarak 100-200 civarı nükleotit sekanslanabilir. Sekanslama işleminin hızı, kullanılan COMS çiplerinin hızı ve kapasitesi ile de alakalıdır.

Bu yöntemi öne çıkaran bir diğer detay ise, bu metotta modifiye edilmiş enzim ve nükleotitlerin kullanılmasına gerek olmayışıdır. Illumina, Sanger gibi yöntemlerde kullanılan ddNTP’nin bu yöntemde kullanılmasına gerek yoktur, normal dNTP yeterlidir.

Bu avantajlarının yanı sıra birtakım kısıtlayıcı eksikler de mevcuttur. Birincisi, eğer kalıp DNA’da homopolimer dizileri varsa (TTTTTTT gibi), bu açığa birden çok hidrojeni art arda çıkaracağı için (unutmayınız: her kuyuda her döngü için tek bir dNTP türü kullanılır) elektrik sinyali oldukça büyük olacaktır, bu durumda kaç tane aynı nükleotitten bulunduğunu tespit etmek mümkün olmayacaktır. Elde edilen tek veri, kuyuda mevcut bulunan nükleotit türünün DNA’da bir homopolimer dizi şeklinde bulunduğu olacaktır.

Wikipedia

Pyrosequencing (Pirodizileme) Yöntemi

Tarihçesi

Pyrosequencing sentez bağlı sekanslama yöntemlerinden bir diğeridir. Pyrosequencing metodu ilk olarak 1993 yılında, Bertil Pettersson, Mathias Uhlen ve Pål Nyren tarafından tasarlanmıştır. Bu bilim insanlarının katı faz sekanslama tekniği; 3’ 5’ Ekzonükleaz aktivitesi içermeyen DNA Polimeraz içeren, Streptavidin kaplı manyetik boncukları ve Lusiferaz tarafından algılanan lüminisans saptanmasını içermekteydi.

1998’de Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen ve Pål Nyren tarafından sisteme Apiraz enzimi eklenmiştir. Bu enzim DNA’ya dahil edilmeyen dNTP’leri ortamdan uzaklaştırarak deneyin verimliliğini korumayı sağlar. Apiraz’ın eklendiği yöntem daha sonrasında 4 enzimli metot olarak adlandırılmıştır.

Neden Kullanılır?

Bu sekanslama yöntemi mevcut bulunan yöntemlerin büyük bir çoğunluğundan daha hızlıdır. Klasik sekanslama ve dizileme işlevlerinin yanı sıra Pyrosequencing’in özellikle kullanıldığı başka alanlar da vardır.

Hata oranının düşük olması ve hızlı olması nedeniyle bu metot özellikle tek nükleotitlik değişimlerin (SNP) tespitinde kullanılır. Yine aynı avantajları nedeniyle toprak, su gibi örneklerde bulunan farklı mikrobiyal canlıların türünün tespitinde ve genomlarının sekanslanmasında sıklıkla kullanılır.

Nasıl Çalışır?

• Pyrosequencing, DNA sentezi sırasında salınan pirofosfatın (PPi) saptanmasına dayanan bir DNA sıralama tekniğidir. Bir dizi enzimatik reaksiyonda, dahil edilen nükleotitlerin sayısı ile orantılı olan görünür ışık üretilir. Kaskad, inorganik PPi'nin polimeraz tarafından nükleotit birleşmesinin bir sonucu olarak salındığı bir nükleik asit polimerizasyon reaksiyonu ile başlar. Açığa çıkan PPi, daha sonra, lusiferini oksitlemek ve ışık üretmek için lusiferaza enerji sağlayan ATP’ye, ATP sülfürilaz tarafından dönüştürülür. Reaksiyon ortamına eklenen nükleotit bilindiğinden, şablonun sekansı tek tek nükleotit ekleyerek belirlenebilir, yani ışık görüldüğünde ortama eklenmiş olan nükleotit bilindiği için sekanslanan nükleotit de bilinmiş olur. Standart pyrosequencing, nispeten yavaş bir polimeraz olan Escherichia coli DNA Polimeraz I'in Klenow fragmentini kullanır.
• Pyrosequencing’de kullanılan ATP sülfürilaz, Saccharomyces cerevisiae mayasından elde edilen rekombinant bir versiyondur ve lusiferaz, Amerikan ateş böceği Photinus pyralis'ten elde edilir. Polimerizasyondan ışık tespitine kadar genel reaksiyon, oda sıcaklığında 3–4 saniye içinde gerçekleşir. Bir pyrosequencing reaksiyonunda bir pmol DNA, 6*10¹¹ ATP molekülü verir ve bu da 560 nanometre dalga boyunda 6*10⁹ fotondan daha fazlasını üretir. Bu ışık miktarı, bir fotodiyot, fotoçoğaltıcı tüp veya bir kamera tarafından kolayca tespit edilebilir. Halihazırda kullanılabilen iki farklı pyrosequencing metodu vardır: katı fazlı pyrosequencing ve sıvı fazlı pyrosequencing. Katı fazlı dizileme, daha önce açıklanan üç enzimli sisteme eklenmiş DNA'yı kullanır. Bu sistemde, her nükleotit ilavesinden sonra fazlalık substratı uzaklaştırmak için bir yıkama işlemi gerçekleştirilir. Sıvı fazda, patatesten elde edilen ve nükleotit parçalayan bir enzim olan apiraz kullanılır. Bu enzimin eklenmesi, katı faz ihtiyacını ve ara yıkama basamağının ihtiyacını ortadan kaldırarak pyrosequencing reaksiyonunun tek bir tüpte gerçekleştirilmesini sağlar. Bu enzim aynı zamanda yüksek katalitik aktivite gösterir ve pyrosequencing reaksiyon sistemindeki bu enzimin düşük miktarları, birleştirilmemiş nükleosit trifosfatları önce nükleosit difosfatlara ve ardından nükleosit monofosfata etkili bir şekilde indirger. Apiraz, diğer nükleotit parçalayıcı enzimlere kıyasla ürünleri tarafından daha az inhibe edilir. Bu enzim primer tasarlama aşamasında da esneklik sağlar.

SpringerLinks

• "Sentez yoluyla dizileme", dizilenecek DNA'nın tek bir zincirinin alınmasını ve ardından tamamlayıcı zincirin enzimatik olarak sentezlenmesini içerir. Pyrosequencing yöntemi, başka bir kemilüminesan enzim ile DNA polimerazın aktivitesinin saptanmasına dayanır. Esasen yöntem, tek seferde bir baz çifti ekleyerek tamamlayıcı zinciri sentezleyerek ve her adımda hangi bazın eklendiğini tespit ederek tek bir DNA ipliğinin dizilenmesine izin verir. Kalıp DNA hareketsizdir ve A, C, G ve T nükleotitlerinin çözeltileri ortama sırayla eklenir ve sonrasında reaksiyondan uzaklaştırılır. Işık yalnızca nükleotidin, kalıbın ilk eşleşmemiş nükleotidine eklenmesiyle ortaya çıkar. Kemilüminesan sinyaller üreten çözelti dizisi, kalıbın dizisinin belirlenmesini sağlar.
• Pyrosequencing'in çözelti bazlı versiyonu için, tek zincirli DNA (ssDNA) kalıbı bir dizileme primerine hibridize edilir ve bu kalıp; DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz, apiraz enzimleri ve adenozin 5´ fosfosülfat (APS), lüsiferin substarları ile inkübe edilir.

Pyrosequencing basamakları kısaca şunları içerir:

1. Dört deoksinükleotit trifosfattan (dNTP'ler) birinin eklenmesi süreci başlatır. DNA polimeraz sıradaki uygun komplementer dNTP'leri kalıba dahil eder. Bu sentez reaksiyonu pirofosfatı (PPi) serbest bırakır. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken, deneyde dATP değil dαSATP kullanılmaktadır çünkü dATP, Lusiferaz enziminin doğal substratıdır; varlığında arkaplanda olmaması gereken ışımalara sebep olacaktır ve bu da verilerin bozulması anlamına gelir.
2. ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında PPi'yi ATP'ye dönüştürür. Bu ATP, lusiferaz aracılı lusiferinin, konsantrasyonuyla orantılı miktarlarda görünür ışık üreten oksilusiferine dönüşümü için bir substrat görevi görür. Lusiferaz katalizli reaksiyonda üretilen ışık, bir kamera tarafından algılanır ve bir programda analiz edilir.
3. Birleşmemiş nükleotitler ve ATP, apiraz tarafından degrede edilir ve reaksiyon başka bir nükleotit ile yeniden başlatılır.

Clinical Chemistry

Pyrosequencing Yönteminin Avantajları ve Dezavantajları Nelerdir?

Bu yöntemin en büyük eksiği, hata okuma ve bulma sistemlerinin olmamasıdır. Örneğin Illumina yönteminde fragmentler küme halinde dizilendiği için ortak bir sekans belirlenebiliyor ve hata yüzdesi minimize edilebiliyordu. Pyrosequencing’de herhangi bir hata okuma sisteminin olmaması, sekansın güvenilirliğini düşürmektedir. Bunun yanında Pyrosequencing’in gerçekleştiği makineler oldukça pahalıdır, bu nedenle bu yöntemin erişilebilirliği sınırlıdır.

Pyrosequencing yönteminin en bariz avantajları ise diğer yöntemlere göre oldukça hızlı olması ve tek döngüde oldukça uzun okuma dizileri verebilmesidir.