Biyologlar Sıfırdan Sentetik Hücreler Üretiyorlar! Peki Nasıl?

Başlangıçta; 2 protein, 3 tamponlama maddesi (İng: "buffering agent"), 2 çeşit yağ molekülü ve biraz kimyasal enerji olmak üzere, sekiz bileşen vardı. Fakat bu, bölünme için gerekli mekanizmaların bir kısmına sahip, ilkel, hücre benzeri yapılar oluşturabilmemiz için yeterliydi.

Biyofizikçi Petra Schwille'e göre, laboratuvarındaki hareketli küçük buluşlar, yeni baştan sentetik hücre üretimi için çok önemli bir adımı temsil ediyor. Schwille, bu amaç doğrultusunda son 10 yıldır çalışmalar yapıyor, bu çalışmalara günümüzde Max Planck Biyokimya Enstitüsü'nde devam ediyor. Schwille'e göre en uğraştırıcı şey ise, hangi bileşenlerin yaşayan bir sistem oluşturmak için gerekli olduğunu saptamak. Şöyle diyor:

Beni hep cezbeden soru şu olmuştur: "Yaşayan ve yaşamayan maddeyi birbirinden ayıran şey nedir?"

Araştırmacılar, 20 yılı aşkın süredir, biyomolekülleri doğru bir şekilde bir araya getirerek yaşam fonksiyonlarını yeniden üretmeye ("replike etmeye"), böylelikle yapay hücreler üretmeye çalıştılar.

Hücrelerde bir sürü fonksiyon olmasına rağmen, bunlar üç ayrı kategoriye ayrılabilir: Bölmelendirme, matebolizma, bilgi kontrolü ya da başka bir deyişle, hücresel talimatların depolanması ve kontrolü.

Mikroakışkan teknolojilerindeki (İng: "microfluidic technologies") ilerlemeler sayesinde, bu doğrultudaki çalışma temposu da sürekli hızlanmakta. Bu teknolojiler sayesinde bilim insanları ufacık hücresel bileşenlerin hareketlerini koordine edebiliyor. Araştırma grupları, hücre benzeri parçacıkları istenilen biçimlere getirmek konusunda, hücre metabolizmasının ilkel versiyonlarını baştan yaratmak konusunda ve el yapımı genomları yaşayan hücrelerin içerisine nakletmek konusunda çeşitli metotlar keşfettiler bile. Ancak, bütün bu elementlerin nasıl bir araya getirileceği günümüzde bile hala bir muamma.

Yine de, bu alanda çalışan insanlar, bu görevi tamamlamaya çok optimist bir şekilde yaklaşır oldular. 2017’nin Eylül ayında, Hollanda’da 17 ayrı laboratuvarda çalışan araştırmacılar bir araya gelerek Building a Synthetic Cell (BaSyC) grubunu kurdular, amaçları ise BaSyC’in yöneticisi, biyofizikçi Marileen Dogterom’un sözleriyle “10 yıl içerisinde; hücre-benzeri, büyüyen ve bölünen bir sistem inşa etmek”. Bu projenin 18.8 milyon Euro'luk bir “Dutch Gravitation” hibe desteği var.

Eylül ayında, US National Science Foundation (NSF) sentetik hücreler üzerine olan ilk programını halka sundu ve bu projeye 10 milyon dolarlık bir bütçe ayırdı. Petra Schwille dahil birçok Avrupalı araştırmacı sentetik hücreleri European Commission’s Future and Emerging Technologies Flagship planlarından biri çerçevesinde yapma fikrini sundu (bu çaptaki planlara genellikle 1 milyar Euroluk bütçe ayrılır).

Tümevarımsal sentetik biyologları yaklaşık 10 yıl içerisinde Dünya'daki ilk, tamamen yapay hücrenin oluşumuna tanıklık edebileceğimizi öngörüyor.

Bütün Sır Paketlemede!

Araştırma grupları hücre-benzeri (İng: "cell-like") yaşamın bazı elementlerini baştan yaratmak konusunda büyük ilerleme kaydettiler. Özellikle de hücreyi çevreleyen ve içerisindeki bileşenleri bölmelendiren zarları taklit etmede. Çünkü, moleküllerin organize edilmesi onların birlikte çalışmalarını sağlamaktaki püf nokta. Bunu sağlamak milyarlarca bakterinin içini açıp içeriklerini bir test tüpüne boşaltmak gibi değil, çünkü sistemde, bazı bileşenlerin bir arada bulunması gerekirken, bazılarının ise ayrı tutulması gerekiyor. Biyofizikçi Cees Dekker bu konuda şöyle diyor:

Bana göre, bütün mesele moleküllerin sosyolojisine bağlı.

Bunun anlamı, biyomoleküllerin lipid zarlarının üzerinde ya da içerilerinde organize edilmesi gerektiği. Schwille ve ekibi bunu sağlamak konusunda büyük ilerleme kat ettiler. Bu ekip, yaklaşık 10 yıldan beri, görevi bakteri hücrelerinin hücre bölünme mekanizmalarını yönetmek olan Min proteinlerini lipidlerden yapılma yapay membranlara eklemeye başladılar. Araştırmacılar, bu proteinlerin membrandan çıkıp tekrar girmesi sonucunda zarın dalgalanarak savrulduğunu fark ettiler. Fakat, Min’leri 3 boyutlu küresel lipid yapılarına eklediklerinde, bu yapıların patladıklarını gördüler. Schwille ve ekibi bu problemin önüne mikroakışkan teknolojileri kullanıp hücre boyutlarında zar (İng: "membrane") taşıyıcılar (ya da lipozomlar) yaparak geçtiler. Bu lipozomlar birçok proteinin membrandan girişine veya membranın içine girişine karşı dayanıklıydı.

Nature

Schwille’in yüksek lisans öğrencisi Thomas Litschel ve onun meslektaşları, Min proteinlerini suda çözüp bu karışımdan birkaç damlayı hızlıca döndürülen bir test tüpüne eklediler. Tüpün dönmesi ile meydana gelen merkezkaç kuvveti, damlacıkları yoğun lipid tabakalarının içinden geçirdi, bu sayede Min proteinleri lipid membranları ile çevrelenmiş oldu. Bütün sürecin sonunda, 10-20 mikrometre çapında lipozomlar elde ettiler. Bu lipozomları, ya da dev, tek katmalı vesikülleri (GUV’ler) elde etmenin farklı farklı yolları var. Fakat Litschel’in kontrolündeki süreçte, Min proteinleri, oluşan GUV’lerin titreşmelerine, rastgele hareket etmelerine ve merkeze doğru büzülmelerine yol açtı.

Schwille’in grubu zar deseni (İng: "membrane pattern") oluşturabilen ve kendi kendini organize edebilen Min proteinleri hakkında sahip oldukları bilgi birikimini avantaja çevirmeyi hedefliyor. Litschel’in çalışmaları ise ekibin bu proteinleri sentetik hücrelerinin membranlarına bölünme ya da bileşen toplama amacıyla şekil verme amacıyla kullanabileceklerini gösteriyor, tıpkı fizikçilerin koli bandı ve alüminyum folyo ile deneylerine ince ayarlar yaptıkları gibi. Schwille bu kullanışlı moleküller ile hücre-benzeri yapıları manipüle edebileceğini umut ediyor.

Cees Dekker’in grubu da benzer bir şekilde, lipozomların içerisine mikroakışkan çipler (aşağıdaki görselde görebilirsiniz) aracılığıyla kendi proteinlerini koymayı becerdiler. Çipin üzerinde, lipid molekülü içeren iki kanalcık su taşıyan daha büyük bir kanal üzerinde bir araya geliyor, böylelikle de hücre boyutunda lipozomları dışarı atıyor. Bu lipozomlar, gerek membranlarına sıkışmış bir şekilde gerek iç kısımlarında çeşitli biyolojik moleküllere ev sahipliği yapabiliyor.

Dekker’in grubu, lipozomları hücreleri daha iyi taklit edebilmek adına baskılayarak, deforme ederek ve yeniden şekillendirerek küresel olmayan formlara getirmeye çalıştılar. Mikroakışkan cihazlar araştırmacılara mikrokanallar kullanarak lipozomları hareket ettirme, sıralama ve manipüle etme olanağı sundu, tıpkı bir elektrik devresindeki gibi. Dekker Lab, bu sene içerisinde, bir lipozomu mekanik olarak, keskin bir uca ittirerek ikiye bölebilen bir çip tasarladı. 

Dekker, ana hedeflerinin bu olmadığını, ama bunun kendilerine bir hücreyi bölmek için ne kadar kuvvet uygulanması gerektiği ve lipozomların ne tür fiziksel manipülasyonları tolere edebildiğine dair ilginç bilgiler sunduğunu belirtti. Aynı şekilde, bu ekip Escherichia coli hücrelerinin şekilleri ile de oynamalar yaptı. Bu hücreleri, nanofabrikasyon ile üretilen silikon bölmeler içerisinde yetiştirerek bu hücreleri istedikleri gibi genişletiyor ya da kare şekline sokabiliyorlardı. Bu sayede, hücre şeklinin bölünmeyi nasıl etkilediği ile ilgili ve Min proteinlerinin farklı boyutlardaki ve şekillerdeki hücrelerde nasıl çalıştıkları ile ilgili fikir sahibi oldular.

Sisteme Enerji Katmak...

Artık lipozomlara, bileşenleri sorunsuzca eklemek mümkün olduğuna göre, çalışma grupları bu moleküllerin nasıl bir arada çalışacağını planlamaya başlayabilir konuma geldiler. Yaşamsal belirtiler gösteren her şeyde, genelde ATP olmak üzere hücresel enerji bulunmak zorunda. Bu her ne kadar dışarıdan sentetik bir sistemi besleme amacıyla yapılabilse de, tümevarımsal biyologlar (bottom-up biologists), gerçek bir sentetik sistemin, canlı hücrelerdeki mitokondri gibi, kendi enerji santrali olması gerektiğini savunur.

Almanya’daki Max Planck Medikal Araştırma Enstitüsü ‘nde Joachim Spatz’ın grubu bir vesikül içerisinde ATP üretebilen ilkel bir mitokondri üretti.

ATP üretimini gerçekleştirmek için, yeni mikroakışkan teknolojileri kullandılar. İlk olarak dev, tek katmanlı vesikülleri (GUV) viskoz polimerlerden yapılma bir kabuğun içerisinde bulunan, yağ içerisinde enkapsüle edilmiş sudan oluşan damlacıklara (water-in-oil droplets) yerleştirerek sabitlediler. Bu damlacıklar sabitlendikçe de GUV’ler bu damlacıklar aracılığıyla mikrokanalcıkların içerisinden akmaya başladı. Ekip, bu damlacıkların içerisine ya zar yüzeyinde tutunan ya da direkt vesikülün içerisine giren büyük proteinler yerleştirdi (Aşağıdaki görselde daha detaylı görebilirsiniz).

Nature

Bu zarlara, moleküler boyutlardaki bir dinamo gibi çalışan, protonların zardan geçmesiyle haberci (precursor) moleküllerden ATP üretimini sağlayan ATP Sentaz isimli bir enzim enjekte edildi. Joachim Spatz’ın ekibi GUV’lerin dışında kalan protonları asit ekleyerek süreci hızlandırdı ve membranın iç yüzeyinde ATP üretimini tetiklediler. 

Spatz, fazladan bir protein enjeksiyonu için GUVleri mikrokanalların içerisinde bir tur daha döndürebildiklerini, böylelikle periyodik olarak bileşen eklemekte başarılı olduklarını söylüyor. Bir sonraki aşama ise, aynı prensibi kullanarak sisteme proton gradyanları eklemek.

Max Planck Karasal Mikrobiyoloji Entitüsü’nde çalışan, Tobias Erb isimli bir biyokimyacı tarafından yönetilen başka bir sentetik biyolojisi grubu hücrelerde metabolik yolaklar üretebilmek için başka yaklaşımlarda ilerleme kaydetti. Erb özellikle fotosentetik mikropların çevredeki karbondioksidi toplayıp bunlardan şeker ve başka yapıtaşları oluşturmalarını sağlayan yolaklarla ilgileniyor ve bu sistemlere bir mühendis bakış açısı ile yaklaşıp nasıl tasarlayacaklarına kafa yorduklarını, sonra bunu laboratuvarlarında gerçekleştirdiklerini söylüyor.

Bu ekip, karbondioksidi, fotosentezde üretilen önemli bir metabolit olan “malat”a dönüştürebilen bir sistem tasarladı ve bu yarattıkları yolağın fotosentezden daha bile verimli olacağını öngördü. Sonrasında, bu yarattıkları yolakların aşamaları içerisindeki tepkimeleri gerçekleştirebilecek enzimler araştırmaya başladılar. Bu enzimlerden birkaçı istedikleri sonucu vermediğinden bunları yeni baştan üretmek zorunda kaldılar. 

Sonuç olarak, Escherichia coli, bir arkebakteri, Arabidopsis bitkisi ve insanlar da dahil olmak üzere 9 farklı organizmadan 17 farklı enzim buldular. Fakat elde edilen sonuç çok verimsiz ve yavaş süren bir tepkimeler zinciriydi. Erb bu konuda, şöyle diyor:

Birtakım enzimleri bir araya koyduk fakat bundan güzel sonuçlar doğmadı, bu enzimler üzerinde yaptığımız birkaç değişiklikten sonra ‘Versiyon 5.4’e kadar ulaştık ve bu versiyon, fotosentezden yüzde 20 daha verimli bir şekilde çalıştı.

Bu çalışmaların üstüne, Erb’in grubu sentetik bir kloroplastın ilkel bir versiyonunu yapmaya başladı. Bir miktar ıspanağı mikserde öğütüp bünyelerindeki fotosentez sistemini bir test tüpü içerisinde ellerinde bulunan enzimlere ekleyerek elde ettikleri ürün ile, hem ATP üretimi hem de karbondioksidin malata dönüştürülmesi süreçlerini gerçekleştirebiliyorlardı ve bunu yapmak için tek ihtiyaçları olan bir ultraviyole ışık kaynağıydı.

Bütün sistem bir test tüpü içerisinde anlık olarak çalışabiliyor, fakat Erb bu sistemi bir kloroplast gibi bölmelendirmeyi istiyordu. Bunu gerçekleştirebilmek için sentetik biyologlarıyla birlikte çalıştı. Kate Adamala bu sentetik biyologlarından bir tanesi.

Adamala ve grubu, Minnesota Üniversitesi’nde programlanabilir biyoreaktörler üretmek üzerine çalışıyor. Bunun için yaptıkları şey lipozomlara basit genetik devreler ekleyip bu devreleri birleştirerek daha kompleks biyoreaktörler yaratmak. Bu biyoreaktörleri, Schwille’in grubunun kullandığına benzer bir dönen tüp sistemi kullanarak üretiyorlar. Araştırmacılar, bu tüplere spesifik bir görevi gerçekleştirmesini amaçlayıp ürettikleri plasmid isimli halkasal DNA parçalarını ve bu DNA’dan protein üretebilmek için gerekli olan bütün mekanizmayı eklediler. 

Örneğin, zarlarında bulunan porlar aracılığıyla çevredeki bir antibiyotiği algılayabilen ve tepki olarak biyolüminesans sinyal yaratabilen lipozom biyoreaktörleri üretmekte başarılı oldular.

Sırayla, basit biyoreaktörleri bir araya getirerek daha kompleks genetik devreler kurabiliyorlar. Fakat yarattıkları bu sistem on biyoreaktör gibi bir sayıya ulaştığında parçalanmaya başlıyor.

Adamala’ya göre bu, bu alanda karşılarına çıkan en büyük zorluklardan bir tanesi. Gerçek bir hücre içerisinde, birbirleri ile çakışan görevler yapan proteinler çeşitli mekanizmalar ile ayrı tutulabiliyor fakat sentetik hücrelerde aynı işlevi gerçekleştirecek başka bir yol bulunması gerekli. Bu yol, ya deneyi yapan kişinin hangi lipozomların ne zaman bir araya getirileceğine karar vermesiyle dışarıdan bekçiliğin (gatekeeping) sağlanmasıyla ya da bir tür zamanlı salım (time release) sistemi ile hangi lipozomların bir araya gelebileceğini belirleyen kimyasal etiketlerle olacak.

Bilgi Aktarım Enjeksiyonları

Yapay hücre üretiminde dikkat edilmesi gereken başka bir detay da yazılımı doğru ayarlamak. Sentetik bir hücrenin onu yapan bilim insanının talimatlarını takip etmesi ve kendini çoğaltabilmesi gibi şeyleri gerçekleştirebilmek adına bilgiyi depolama ve tedarik edebilmesi gerekiyor. Bizim hücrelerimizde bu, genetik kodumuz ile sağlanan bir şey. 

Sentetik bir hücrede kaç genin gerekli olduğu hala devam eden bir tartışma konusu, Schwille gibileri, birkaç düzine derken Adamala gibi başkaları da 200-300 arasında gen olmalı diyor. 

Daha başka insanlar ise yaşayan bir şeyle başlamanın en doğrusu olduğunu savunuyor. Kaliforniya’daki J. Craig Venter Enstitüsü’nde (JCVI) çalışan sentetik biyoloğu John Glass ve meslektaşları bilinen en küçük mikrobiyal genomlardan biri olan Mycoplasma mycoides bakterisinin genomunu aldılar ve esansiyel olanları ayırmak için genleri sistematik bir şekilde dağıttılar. Bu genlerin hangileri olduklarını saptadıktan sonra, kimyasallar aracılığıyla bunları bir araya getirdiler.

Elde ettikleri son genomda 473 gen bulunmakta. Bu, kullandıkları organizmada normalde bulunanın yarısına yakın bir değer. 2016’da, ekip bu genlerin bağımsız fakat yavaş büyüyen bir organizmayı aktive edebildiğini kanıtladı. Glass, 473 sayısını küçültmenin çok zor olduğunu, küçültülmesi durumunda sonucun yüksek ihtimalle hücrenin ölümü ya da büyümeyi tamamen bırakması olduğunu söylüyor. 

Glass ve JCVI’deki meslektaşları yarattıkları son yapay hücre olan JCVI-syn3.0a’yı baz alarak “hücresel görevler” başlıklı bir liste derliyorlar ve bu JCVI-syn3.0a’yı kullarak bir hücrenin yaşaması için yapması gereken şeylerin minimal bir “yapılacaklar listesi” olarak kullanmayı hedefliyorlar. Fakat orijinalde buldukları 473 genin yaklaşık 100 tanesinin hangi karakteristik görevi gerçekleştirdiğini henüz saptayamadılar. 

Bir sonraki aşamada, JCVI-syn3.0a genomunun DNA’yı proteine çevirmek için gerekli olan mekanizmayı barındıran bir sentetik lipozoma aktarılması bulunuyor. Bunun yapılabilmesi için NSF (National Science Foundation) tarafından bu süreçte bir arada çalışan Glass ve Adamala’ya 1 milyon dolarlık destekte bulundu. Bu aşamanın sonunda hücrenin hayatta kalıp kalamadığı incelenecek. Hayatta kalması durumunda hem donanımı hem de yazılımı tamamıyla sentetik olan bir hücre elde etmekte başarılı olunmuş olur. 

Hayatta kalmakla birlikte büyüyüp çoğalabilmesi durumu ise çok büyük bir adımın geride bırakılması demek. Fakat geniş bir kitle, hücrenin eğer canlı bir sistemi temsil etmesi isteniyorsa evrilme ve çevresine adapte olma gibi davranışları da gerçekleştirmesi gerektiğini savunuyor. Schwille’e göre bu hedef en beklenmedik sonuçları doğurabilecek önemli adımlardan bir tanesi. Bir hücrenin canlı olduğunun kabul edilebilmesi için, yeni fonksiyonlar geliştirebiliyor olması lazım.

Glass’in ekibi JCVI’da JCVI-syn3.0a ile, besince zengin ortamda en hızlı büyüyen organizmaları elemeye dayalı adaptif laboratuvar evrimi deneyleri gerçekleştirdi. Şimdiye kadar, yaklaşık 400 bölünmeden sonra, gerçek bir organizmadan yüzde 15 daha hızlı büyüyebilen hücreler elde etmeyi başardılar. Bununla birlikte, bir sürü gen dizini değişimi gözlemlediler. Fakat hücrenin hala yeni fonksiyonlar üretip üretmediğine dair ortada bir kanıt yok.

Sentetik Hücreler Bize Neler Vaat Ediyor?

Sentetik hücreler başka gezegenlerde yaşamın nasıl olduğuna dair ipuçları açığa çıkarabilirler ve araştırmacıların tam kontrölüne sahip oldukları sentetik biyoreaktörler kanser tedavilerinde, antibiyotik direnci saptamada ya da zehirli atıkların temizlenmesinde yeni çözümler doğurabilir. Bu çeşit bir organizmayı insan vücuduna ya da doğaya yerleştirmek çok riskli, fakat bilinmeyen ve öngürülemeyen davranışlara sahip, bir tümdengelimsel mühendislik (İng: "top-down engineering") sürecinden geçmiş bir organizma daha bile riskli olabilir. 

Dogterom canlı sentetik hücrelerle birlikte “Bu yeni bir yaşam formu mu olacak?, Hücre bağımsız mı olacak?, Bizim kontrolümüz altında mı olacak?” gibi felsefi ve ahlaki soruların ortaya çıktığını söylüyor. Bu hücrelerin kontrolden çıkıp kaotik sonuçlar doğurması konusunda da daha az endişeli olduğunu “İlk sentetik hücrelerimiz çoktan var olan şeylerin birer taklidi olacağından eminim.” diyerek belirtiyor. Ayrıca böyle bir durum ile karşı karşıya kalınması durumunda da hücreyi zararsız kılacak bir tür “kapatma tuşu” bulunduruluyor.

O ve diğer sentetik biyologları çalışmalarına devam edip yaşamın sınırlarını keşfetmeye devam edecekler. Dogterom’un sözleriyle;

Genomların ve parçaların listesi elimizde. En minimal hücrenin canlılık belirtisi göstermesi için sadece birkaç yüz gen yeterli. Yüzlerce parça ile uğraşmak tabii ki zor bir şey olacak, ama sonuçta binlerce parça değil ve bu çok heyecan verici.